基于Ki-67增殖指数判定的数字化分析在胃肠胰神经内分泌肿瘤分级中的应用

涂 轶，曹 毅，徐 姗，郑紫纯，周志斌，梅金红

神经内分泌肿瘤(neuroendocrine neoplasm, NEN)是一组起源于肽能神经元和神经内分泌细胞的异质性肿瘤[1]。胃肠胰分布多种神经内分泌细胞，是NEN最常发生的部位，约占所有NEN的75%，目前已成为消化道常见的恶性肿瘤[2]。NEN增殖活性的级别判定主要采用核分裂象和(或)Ki-67增殖指数两项指标，在国内，大多采用Ki-67增殖指数对NEN进行分级，准确的肿瘤分级对于指导NEN患者的治疗及预后评估具有重要作用。人工精确计数法对Ki-67增殖指数判读较为准确，但其需计数500～2 000个细胞，耗时长，诊断效率低。因此，目前对于Ki-67增殖指数评估仍以病理医师目测估计显微镜下的组织切片为主，该方法简单、方便，但具有较强主观性，结果可重复性差，造成Ki-67增殖指数判读不准确[1]。腾讯精准医疗开放平台通过一体化全自动扫描平台，将传统的玻璃切片进行扫描，生成包括传统玻璃切片内的所有信息的数字化切片，通过软件对切片信息进行分析，进行Ki-67增殖指数的判读，具有高效、结果可重复等优点。本实验拟验证基于Ki-67增殖指数判定的数字化NEN分析的精确性，及与人工精确算法的一致性，探讨采用数字化手段对Ki-67增殖指数判定的可行性，以解决当前Ki-67人工目测评估进行肿瘤分级所存在的结果可重复性差、耗时、主观性强等问题。

1 材料与方法

1.1 标本来源选取2016年1月～2020年11月南昌大学第一附属医院病理科确诊的349例胃肠胰NEN的Ki-67免疫组化病理切片，包括分级在G1、G2、G3的各级胃肠胰NEN。其中G1期278例，G2期20例，G3期51例。肿瘤位于直肠232例，胃67例，胰腺31例，乙状结肠8例，右半结肠7例，十二指肠3例，回盲部1例。

导入各病例原病理报告Ki-67增殖指数判断结果作为病理医师目测评估肿瘤细胞Ki-67增殖指数。

1.2 数据处理及分析使用尼康显微镜进行NEN Ki-67免疫组化切片观察。每张切片先在低倍镜(40×)下确认阳性率最高的区域，再调整为中倍镜(200×)精确定位Ki-67阳性率最高的区域，运用数字化切片扫描仪(Motic EasyScanner)记录数字化切片图像。为保证足够的细胞数目，对于神经内分泌组织细胞比较多且存在明显Ki-67热点的切片，选取2～3幅包含阳性率最高区域的图片；对于NEN细胞比较少或无明显Ki-67热点的切片，则选取包含切片中全部肿瘤组织的图片，确保每例至少500个肿瘤细胞进行评估。运用Photoshop CS5进行图像处理，主要对图片中非肿瘤区域(如间质及正常胃肠黏膜组织)进行切割，调节图片的亮度以满足腾讯精准医疗开放平台软件对于图像的要求，去除图片中较明显的非细胞污点(如切片久置被污染所致的污点等)。通过腾讯精准医疗开放平台软件数字化分析(简称数字化分析)进行Ki-67增殖指数分析，每例均上传其对应的图片及背景色图片，然后保存分析结果图片(图1、2)。

图1 Ki-67增殖指数，人工精准计数结果分别为：<1%(A)、5%(B)、30%(C)；病理医师目测Ki-67增殖指数结果分别为3%、4%、35% 图2 腾讯精准医疗开放平台软件数字化分析Ki-67增殖指数结果，分别为<1%(A)、5%(B)、31%(C)

对每个NEN病例的Ki-67免疫组化图片进行人工计数精确评估Ki-67增殖指数。选取Ki-67阳性率最高的图片进行人工计数，分别数出Ki-67阳性核(褐色着色)的个数和阴性核(蓝色着色)的个数。如果1幅图片的总细胞数目小于500，则选取余下几张图片里Ki-67阳性率最高的图片继续进行人工计数，直至累计总细胞数目超过500。计算Ki-67阳性核肿瘤细胞数占总细胞数的百分比并记录。

用Excel软件绘制人工精确计数与数字化分析结果的散点图。再运用Excel软件散点图中“添加趋势线”，选择“线性”对图像进行线性拟合，并显示公式。运用SPSS 20.0软件对两种计数结果进行配对t检验。运用Graphpad 8.0软件分别对G1、G2及G3期的数字化分析与人工精确计数，病理医师目测与人工精确计数进行Bland-Altman一致性检验分析。

2 结果

从分析时间上看，数字化分析出结果的时间是3～5 s，不同组织大小扫描时间不一，500个肿瘤细胞扫描时间约在1 min以内，截图及上传图片时间约10 s；人工精确计数的时间是3～5 min；医师目测法判定Ki-67增殖指数结果约10 s。

在时效上数字化分析效率优于人工精确计数。

数字化分析结果与人工精确计数的比较结果显示两者具有较好的相关性，其线性相关系数为0.985，且SPSS软件t检验结果显示两者Pearson相关系数为0.997，差异有统计学意义(P<0.000 1)。

数字化分析与人工精确计数相比，G1期278例配对数据差值的均数d=-0.028 8，差值的标准=0.267 6，95%一致性界限为[-0.553 4，0.495 7]。G2期20例配对数据差值的均数d=-0.400 0，差值的标准=1.231，95%一致性界限为[-2.813，2.013]。G3期51例配对数据差值的均数d=0.902 0，差值的标准=5.155，95%一致性界限为[-9.201，11.01]。

病理医师目测与人工精确计数相比，G1期278例配对数据差值的均数d=0.083 0，差值的标准=0.356 6，95%一致性界限为[-0.615 8，0.781 9]。G2期20例配对数据差值的均数d=1.850，差值的标准=0.933 3，95%一致性界限为[0.020 7，3.679]。G3期51例配对数据差值的均数d=-4.020，差值的标准=10.03，95%一致性界限为[-23.68，15.64]。

数字化分析与病理医师目测法相比，G1期278例配对数据差值的均数d=0.111 9，差值的标准=0.479 8，95%一致性界限为[-0.828 4，1.052]。G2期20例配对数据差值的均数d=2.250，差值的标准=1.293，95%一致性界限为[-0.283 7，4.784]。G3期51例配对数据差值的均数d=-4.902，差值的标准=10.75，95%一致性界限为[-25.97，16.17]。

由此可见，数字化分析与人工精确计数在G1、G2及G3期均具有较好的一致性，其中G1期的一致性高于G2期，G2期的一致性高于G3期。且数字化分析与人工精确计数的一致性均高于病理医师目测与人工精确计数以及数字化分析与病理医师目测的一致性，差异有统计学意义。

3 讨论

NEN是一类起源于肽能神经元和神经内分泌细胞的异质性肿瘤，可发生于全身多器官和组织，包括胃肠道、胰腺、胆道、肝脏、肺支气管、甲状腺及甲状旁腺等部位。NEN的早期诊断率低，确诊时往往出现转移，病死率居高不下，近年来受到越来越广泛的重视。此前较长一段时间内，对NEN的命名、分类、诊断及治疗均缺乏统一和规范，仍存在诸多尚待解决的问题[3]。

WHO(2010)消化系统肿瘤分类对NEN命名、分类和分级进行了修订，将NEN分为高分化的神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumor, NET)G1期(Ki-67增殖指数<3%)、G2期(Ki-67增殖指数为3%～20%)和分化差的神经内分泌癌(neuroendocrine carcinoma, NEC)G3期(Ki-67增殖指数>20%)三部分，认为高分级G3即为分化差的NEN[4]。WHO(2017)消化系统肿瘤分类进一步将NEN G3分级细化为高增殖活性的NET G3及NEC G3。高增殖活性NET G3 Ki-67增殖指数通常为20%～50%，NEC G3期Ki-67增殖指数>50%[5]。指南明确指出完整的病理报告中需要包括确切的Ki-67增殖指数[6]，这对指导NEN患者的治疗及预后评估具有重要意义。

目前对Ki-67增殖指数的判读主要人工判读为主，传统的人工判读Ki-67增殖指数存在以下缺点：(1)精确性低，病理医师通过肉眼在显微镜下短时间内判读一张病理切片，准确性不高；(2)主观性强，选取的视野不同，对阳性信号的判读不同，均可导致判读结果有差异；(3)重复性差，不同病理医师之间、同一病理医师不同时期的阅片均存在明显差异[7-8]。此外，新版诊治标准中强调了组织标本量对分级判断可靠性的影响，肿瘤细胞数量不足，分级可能会被低估，从而难以得到准确的评估分级结果。病理医师目测估计计数存在上述的诸多问题，可能导致Ki-67增殖指数判定误差，从而影响NEN的分级及术后治疗、预后判断。相比传统的人工判读，数字化分析在以下几方面具有优势：(1)与病理医师目测估计计数相比，采用数字化分析方法，对Ki-67增殖指数进行判读，准确率高，因此Ki-67增殖指数的判读结果更可靠；(2)省时省力，在完成切片扫描后，对于选定的视野只需数秒就可完成阅片过程；(3)客观性好，判断标准统一，在判断阳性标准设定后，所有切片均会按相同条件进行判读，计算阳性率；(4)重复性好，可以进行多视野计数，虽然本实验仅选取2～3个视野进行计数，但在实际工作中，机器判读可以选取任意更多的有代表性的区域，甚至可以进行整片计数，最大限度的保证了阅片结果的稳定性。机器判读更注重细节且更易进行质控[9]。

本组共纳入349例确诊为胃肠胰NEN并进行Ki-67免疫组化的病理切片，通过Pearson相关系数检测数字化分析与人工精确计数对诊断Ki-67的相关性，结果显示数字化分析与人工精确计数具有良好相关性。其次，通过Bland-Altman一致性检验分析数字化分析与人工计数对G1、G2及G3期的Ki-67增殖指数精确度比较，结果显示数字化分析与人工精确计数在G1、G2及G3期均具有较好的一致性，其中G1期的一致性高于G2期，G2期的一致性高于G3期，且G1、G2、G3期数字化分析与人工精确计数的一致性均高于病理医师目测与人工精确计数以及数字化分析与病理医师目测的一致性。因此，通过上述结果，可以初步得出，数字化分析Ki-67增殖指数并协助诊断NEN具有很好的临床应用价值，其准确性优于人工精确计数。因本实验是单中心、小样本的回顾性分析，则需要更大样本量、多中心、前瞻性研究进一步证明通过机器数字化分析Ki-67增殖指数对确诊和分级NEN的价值，从而为病理科医师诊断NEN提供更加准确、快速的检测方法和循证学依据。

综上所述，本实验初步认为数字化分析进行NEN的Ki-67增殖指数判断，相比病理医师目测估计，能够更好地保证有效的肿瘤细胞数，数字化判定结果较病理医师目测估计更为精确，与金标准人工精确计数相比具有很好的一致性。数字化分析可能成为精确评估Ki-67增殖指数的新方法，从而进行肿瘤恶性程度的准确分级，解决当前Ki-67增殖指数人工目测评估精确性差、费时、主观性强、可重复性差的问题，并有望在诊断其他恶性实体肿瘤的免疫组化指标判定上进行推广。