基于CRISPR/Cas9技术构建Atg7基因敲除的人脑微血管内皮细胞系

李雯卉， 刘辉， 李泽烨， 韦佳祎， 陈誉华

血脑屏障是中枢神经系统的一个独特结构，它紧密地控制着离子、分子、细胞在血管和脑之间运动[1]。血脑屏障的屏障特性是使神经组织免受毒素和病原体的侵袭，对中枢神经系统稳态的维持至关重要[1-2]。脑微血管内皮细胞是血脑屏障重要的细胞组分，它在血脑屏障的建立以及功能发挥中起关键作用[3-4]。许多研究还发现脑微血管内皮细胞的功能障碍与很多脑血管相关疾病有紧密的联系[5-9]。1992年，Atg7因其在酵母自噬中发挥重要作用而开始被关注[10]，随后它一些新的功能也陆续被研究者发现。近来有研究发现小鼠内皮细胞敲除Atg7能减弱动脉血栓的形成[11]，我们的前期研究也发现，小鼠内皮细胞敲除Atg7不利于脑血管的形成[12]。然而，Atg7在脑血管和参与血脑屏障形态建成的机制尚不清楚。CRISPR/Cas9系统是细菌和古细菌形成的一种免疫防御系统，近年来经人为改造后广泛应用于基因编辑，其原理是通过单一引导RNA序列(sgRNA)识别特定靶DNA序列，将内切酶Cas9引导至靶DNA的设定位置进行切割，使DNA双链断裂，细胞在通过自身非同源性末端修复时，可使目标区域DNA出现插入、缺失等改变，达到基因敲除或改造的目的[13]。我们利用CRISPR/Cas9技术在体外构建Atg7基因敲除的人脑微血管内皮细胞，为Atg7在脑血管的发育和参与血脑屏障形态建成的机制以及脑血管相关疾病的深入研究提供体外细胞模型。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells，HBMEC)(美国Johns Hopkins大学医学院K.S.Kim教授赠送)；……