A20在胆管结扎所致肝纤维化小鼠中的表达及作用机制研究

王晓晗 韩 丰 沈 亮 陈云清 沈月玉 高 晨 侯震涛 冀子中 范竹萍

肝纤维化是影响肝脏疾病转归和肝细胞癌(HCC)风险的关键因素，与肝脏疾病的进展相关[1]。尽管肝纤维化的病因不同，但其进展遵循的模式是类似的。肝星状细胞(HSC)在肝损伤后被激活，产生大量细胞外基质和促炎介质，在纤维生成中发挥着关键作用[2]。

目前已知A20是一种有效的抗炎蛋白。本课题组的既往研究发现，A20参与了肝纤维化的过程，但具体作用机制尚不清楚[3]。本研究主要探讨A20及炎性因子在胆管结扎(BDL)所致肝纤维化模型小鼠肝脏中的表达情况，并在细胞水平探讨A20的作用机制。

1 材料与方法

1.1 BDL所致肝纤维化小鼠模型的构建

采用6～8周龄的C57/B6雄性小鼠，BDL组小鼠(5只)用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，开腹，结扎胆管后关腹。对照组小鼠(5只)不结扎胆管，直接关腹。10 d后处死小鼠，留取肝脏备用。取肝脏组织，浸于4%多聚甲醛中固定，脱水透明，石蜡包埋，0.5 μm切片，脱蜡后行H-E染色，显微镜观察并作图像采集。

1.2 细胞培养

LX-2细胞是永生化的人HSC(购自ATCC)，置于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。使用0.1 μg/mL 脂多糖(LPS)处理LX-2细胞0、5、10、15、30、60 min，收获后冷冻保存备用，检测细胞中A20及炎性反应通路因子的蛋白表达水平变化。

1.3 蛋白质印迹法检测

使用蛋白裂解缓冲液从细胞中提取总蛋白，检测蛋白水平。将不同样品中等量的蛋白质经SDS-PAGE电泳后电转至硝酸纤维素滤膜中。在室温下用5%脱脂牛奶阻断非特异性蛋白结合120 min，将特异性单克隆抗体涂于膜上，4 ℃孵育过夜。……