复配杀菌剂防治平菇尖孢镰刀菌病害的效果测定

张朝辉 张 广 闫 鹏 杜田雨 赵涔岑李明辉 闫新悦 王振河

(1河南科技学院生命科技学院，河南 新乡 453003；2现代生物育种河南省协同创新中心，河南 新乡 453003)

平菇(Pleurotus ostreatus)，学名糙皮侧耳，是世界上广泛栽培的木腐型食用菌，同时也是我国重要的商业化食用菌之一[1]。据报道，平菇产量在我国所有食用菌中居第三位[2]。平菇具有较高的营养价值，富含蛋白质、维生素、海藻糖及矿物质元素；其蛋白多糖能够增强人体的免疫功能，且对癌细胞具有较强的抑制作用，因此具有较高的药用价值[3]。平菇生产中多采用发酵料或生料栽培[4]，极易感染杂菌，但使用杀菌剂会导致药剂滥用和农药残留等问题，限制了我国平菇产业的健康发展[5]。

平菇生产中常见的病害主要包括真菌性病害、细菌性病害和病毒性病害[6]。其中，真菌性病害的病原体与平菇同属真菌，且二者在生理特性方面的差异小，故平菇真菌病害为平菇生产最难防治的病害[7]。镰刀菌(Fusariumspp.)引起的平菇枯萎病，最早报道于1992年[8]，是平菇生产过程中较常见的病原真菌[9]，对平菇生产造成严重的危害。平菇枯萎病主要发生在幼菇阶段，发病初期，菇体呈软腐症状，之后呈失水软革质状，最后菇体变褐而枯萎。若第一潮菇染病严重，第二潮菇在菇体阶段就停止发育而枯萎[8]。在平菇生产中，该病常与平菇其他霉菌病害同时发生，常通过添加适量的单一杀菌剂来防治平菇枯萎病等病害。

平菇生产中专用的杀真菌剂较少，大多来自用于农作物和果树等的杀真菌剂，如多菌灵、克霉灵、使百功、百菌清、甲霜灵·锰锌、代森锰锌和甲基硫菌灵等[10－11]。菇农在平菇生产中常使用单一杀菌剂防治真菌病害，然而长期使用高浓度的单一杀菌剂造成病原菌的抗药性不断增强，形成病害与施药量逐渐增加的恶性循环[12]，进而造成平菇子实体中农药残留超标[11]，严重影响平菇的深加工和出口创汇。而对不同杀菌剂进行复配可以扩大抗菌谱，不仅优于单一药剂的防治效果[12－13]，而且能减少药剂使用量和延缓病原菌出现抗药性，有效延长杀菌剂使用寿命，同时解决食用菌农药残留超标等问题。但目前有关复配杀菌剂在平菇栽培中的应用尚鲜有报道。

本研究选用平菇生产中常用的杀真菌剂使百功、克霉灵和多菌灵[14]，进行两两复配组合，探究复配杀菌剂对平菇生产中常见病原菌尖孢镰刀菌的抑菌效果及其在平菇栽培中的应用效果，以期为开发平菇栽培中适用的新型复配药剂提供理论依据，并为解决食用菌农药残留超标问题提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试药剂 50%使百功可湿性粉剂，上海迪拜农药有限公司，有效成分为咪鲜胺锰盐，是真菌麦角甾醇生物合成抑制剂；50%多菌灵可湿性粉剂，青岛益农化工有限公司，有效成分为N－(2－苯并咪唑基)－氨基甲酸甲酯，干扰病原菌有丝分裂中纺锤体的形成，影响其细胞分裂；40%克霉灵可湿性粉剂，中鑫化工有限公司，有效成分为二氯异氰尿酸钠，溶于水后产生次氯酸，易扩散渗透进入菌体内，使菌体蛋白氧化导致死亡。

1.1.2 供试菌株 平菇(Pleurotus ostreatus):灰美2号，河南省农业科学院食用菌研究开发中心保藏；尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum):河南农业大学农业农村部农业微生物酶工程重点实验室保藏。

1.2 主要仪器与设备

Waters Acquity UPL® CH-CLASS 型超高效液相色谱-Xevo TQD MS 型三重四极杆质谱联用仪，美国Waters 公司；ZXSD－A1160 生化培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；K9840 自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司；B－811 自动脂肪测定仪，瑞士Buchi 公司；752N 紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 药剂配制 复配杀菌剂采用两两组合:使百功＋多菌灵；使百功＋克霉灵；多菌灵＋克霉灵。在平板试验中，根据单药剂的有效中浓度(median effective concentration，EC50)[15]设计复配杀菌剂的加药浓度范围，复配杀菌剂影响尖孢镰刀菌菌丝生长的试验浓度范围设计为0.5～16 mg·L－1，复配杀菌剂影响平菇菌丝生长的试验浓度范围设计为16～512 mg·L－1。两种药剂按质量比1 ∶1进行复配[16]，3 种单药使用的质量浓度与复配药剂一致。袋栽平菇试验中，单药和复配杀菌剂的加药浓度则依据栽培经验中常用加药浓度，按照质量百分比加入。

复配杀菌剂的EC50理论值(X1) 及增效系数(synergistic ratio，SR)的计算参考张权等[17]的方法，计算公式如下:

式中，PA为复配杀菌剂中单药A 的百分含量；PB为复配杀菌剂中单药B 的百分含量；A、B 分别为2 种单药的EC50值，mg·L－1。

式中，X1为复配杀菌剂EC50理论值，mg·L－1；X2为复配杀菌剂EC50实际值，mg·L－1。

通过比较SR 评价复配杀菌剂的联合作用类型，SR>1.5 为增效作用，0.5≤SR≤1.5 为相加作用，SR<0.5 为拮抗作用，从而评价药剂效果[18]。

1.3.2 复配杀菌剂影响尖孢镰刀菌和平菇菌丝生长的测定 采用平板菌丝生长速率法对供试杀菌剂进行室内毒力测定[17，19]。每个处理设定5 次重复，未加药组为CK。菌丝生长速率和相对抑制率的计算参考李月月等[20]的方法。菌丝生长速率(mm·d－1)＝内外圈距离/两次划线间隔时间；菌丝生长相对抑制率＝(未加药组菌丝生长速率－加药组菌丝生长速率)/未加药组菌丝生长速率×100%。

1.3.3 复配杀菌剂在平菇栽培中的防霉菌效果测定 平菇栽培试验采用发酵料栽培方式，栽培料配方为:玉米芯80%、麸皮10%、玉米粉5%、石灰3%、磷酸二铵1%、石膏1%，料水混合，料水质量比1 ∶1.6。建堆发酵和装袋均参见张权等[17]的方法。在最后一次翻堆发酵时加入供试药剂，剂量分别为培养料干重的0.1%、0.2%、0.3%，未加药组为CK，每处理300 个重复。25℃恒温培养，培养开始时，在培养室内采用喷雾法均匀喷洒浓度为1×105CFU·mL－1的尖孢镰刀菌孢子溶液[8]，统计菌丝生长速度、杂菌污染情况及生物学效率[11]。其中杂菌污染的统计阶段是从装袋结束到出菇结束，污染的杂菌通过分离培养，并根据其形态进行鉴定。

1.3.4 农药残留测定 样品的采集、提取、净化和液相色谱及质谱检测均参照贺敏等[10]的方法。质谱条件:电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压3.20 kV；离子源温度150℃；去溶剂温度350℃；以高纯液氮为去溶剂气和锥孔气，去溶剂气流速为550 L·h－1，锥孔气流速为40 L·h－1，碰撞气为高纯氩气；采用多反应离子监测模式，用基质匹配标准溶液的外标法进行定量。

1.3.5 平菇基本营养成分测定 为探究复配杀菌剂对平菇基本营养成分的影响，本试验对平菇子实体中粗脂肪、粗蛋白和粗多糖等含量进行了测定。其中，粗脂肪含量测定根据GB/T 15674－2009[21]的方法；粗蛋白含量测定根据GB/T 15673－2009[22]的方法；粗多糖含量测定依据NY/T 1676－2008[23]的方法。

1.3.6 数据分析 使用GraphPad Prism 7 进行数据处理，结果以平均值±标准偏差形式表示，使用Oneway ANOVA 进行方差分析，P<0.05 被认为具有统计学显著性差异。

2 结果与分析

2.1 复配杀菌剂对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响

由图1 可知，随着药剂质量浓度的增加，单药处理与复配杀菌剂处理对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制效果均逐渐增强，同时，在相同质量浓度时(除0.5 mg·L－1外)，复配杀菌剂对尖孢镰刀菌的抑制作用均显著高于单药。当药剂质量浓度为0.5～16 mg·L－1时，6 种处理(使百功、多菌灵、克霉灵、使百功＋多菌灵、使百功＋克霉灵、多菌灵＋克霉灵)对尖孢镰刀菌菌丝的抑制率分别为1.04% ～62.09%、1.34% ～70.45%、2.24% ～69.85%、7.76%～98.51%、15.37%～97.01%、1.04%～84.18%，其中使百功＋多菌灵、使百功＋克霉灵复配处理对尖孢镰刀菌的抑制效果较好。

图1 复配杀菌剂对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响Fig.1 The influence of fungicide combinations on the fungal growth of F. oxysporum

由表1 可知，单药处理中克霉灵对尖孢镰刀菌的EC50值最低，为9.77 mg·L－1；3 种复配杀菌剂处理(使百功＋多菌灵、使百功＋克霉灵、多菌灵＋克霉灵)对尖孢镰刀菌的EC50值均显著小于各单药，根据增效系数分别表现为增效、增效和相加作用，其中使百功＋多菌灵处理的EC50值最小(3.67 mg·L－1)，其增效系数最大(2.904 9)，效果最好。

表1 复配杀菌剂对尖孢镰刀菌菌丝生长的EC50Table 1 The EC50 of fungicide combinations on the fungal growth of F. oxysporum

2.2 复配杀菌剂对平菇菌丝生长的影响

由图2 可知，随着药剂质量浓度的增加，单药处理与复配杀菌剂处理对平菇菌丝生长的抑制效果均逐渐增强，且在相同质量浓度(128～512 mg·L－1)时，复配杀菌剂(使百功＋多菌灵、使百功＋克霉灵)对平菇的抑制作用高于单药。当药剂质量浓度为16～512 mg·L－1时，6 种处理(使百功、多菌灵、克霉灵、使百功＋多菌灵、使百功＋克霉灵、多菌灵＋克霉灵)对平菇菌丝的抑制率分别为7.18%～62.23%、0.27%～49.07%、0.27%～ 62.23%、 4.90% ～ 63.74%、 12.50% ～ 86.88%、13.16%～86.13%，其中使百功＋多菌灵、使百功＋克霉灵复配对平菇的抑制效果较强，单药剂处理中多菌灵的抑制效果较弱。

图2 复配杀菌剂对平菇菌丝生长的影响Fig.2 The influence of fungicide combinations on the fungal growth of P. ostreatus

由表2 可知，单药处理中使百功对平菇的EC50值小于多菌灵和克霉灵，其对平菇菌丝生长的抑制效果最强；3 种复配杀菌剂处理(使百功＋多菌灵、使百功＋克霉灵、多菌灵＋克霉灵)对平菇的EC50值均显著小于各单药处理，且均表现为增效作用，其中使百功＋克霉灵处理对平菇的EC50值最小(121.97 mg·L－1)，且增效系数最大(2.515 0)，说明该复配杀菌剂对平菇菌丝生长的抑制效果最强。

表2 复配杀菌剂对平菇菌丝生长的EC50Table 2 The EC50 of fungicide combinations on the fungal growth of P. ostreatus

2.3 复配杀菌剂在平菇栽培中的应用效果

2.3.1 复配杀菌剂对袋栽平菇菌丝生长速度的影响 由表3 可知，在平菇发酵料栽培试验中，与CK(未添加药剂)相比，0.2%使百功和0.3%多菌灵处理的袋栽平菇菌丝生长速度显著增加，分别增加了5.1%和6.8%(P<0.05)；使百功＋克霉灵处理的袋栽平菇菌丝生长速度均显著高于CK，其中0.3%使百功＋克霉灵处理的袋栽平菇菌丝生长速度最快，显著高于同浓度的单药处理(P<0.05)。

2.3.2 复配杀菌剂对袋栽平菇生物学效率的影响 由表3 可知，袋栽平菇试验中，与CK 相比，所有复配杀菌剂处理的平菇袋栽生物学效率均显著增加(P<0.05)，增加5.1～22.5 个百分点；除0.3%使百功＋多菌灵和0.1%多菌灵＋克霉灵处理外，其余复配杀菌剂处理的袋栽平菇生物学效率均显著高于同浓度的单药处理(P<0.05)，增加3.2～24.4 个百分点。

2.3.3 复配杀菌剂对袋栽平菇污染率的影响 由表3 可知，袋栽平菇试验中，所有处理的尖孢镰刀菌污染率和其他霉菌的污染率均随药剂质量浓度升高呈降低趋势；与CK 相比，所有复配杀菌剂处理的尖孢镰刀菌污染率均显著降低(P<0.05)，降低1.8～6.5 个百分点；除0.1%多菌灵＋克霉灵处理外，其余复配杀菌剂处理的尖孢镰刀菌污染率均显著低于同浓度的单药处理。其中，0.3%使百功＋克霉灵处理的袋栽平菇尖孢镰刀菌污染率最低，为0.8%，较CK 降低了6.5 个百分点。经鉴定，平菇栽培试验中感染的杂菌主要有绿霉、尖孢镰刀菌、毛霉和根霉等。

表3 复配杀菌剂在平菇栽培中的应用效果Table 3 The applied effect of fungicide combinations in the cultivation of P. ostreatus

2.4 复配杀菌剂对平菇农药残留和基本营养成分的影响

由表4 可知，袋栽平菇试验中，平菇子实体中使百功与多菌灵的农药残留量随药剂质量浓度的增加而增高，复配杀菌剂处理的平菇子实体中使百功和多菌灵的残留量均显著低于同浓度的单药处理。与0.3%使百功和0.3%多菌灵处理相比，0.3%使百功＋多菌灵处理的平菇子实体中使百功和多菌灵残留量分别降低68.0%和73.8%，0.3%使百功＋克霉灵处理的平菇子实体中使百功残留量降低71.8%，0.3%多菌灵＋克霉灵处理的平菇子实体中多菌灵残留量降低68.1%。克霉灵残留量在所有处理中均未检出，可能是因为平菇在新陈代谢过程中将其降解或转化为其他物质。单药或复配使用使百功处理，子实体中的使百功残留量介于12.32～110.95 μg·kg－1之间，远低于我国食品安全国家标准中农药最大残留限量(2 mg·kg－1)[24]和欧盟在新鲜菇类中的最大残留限量(3 mg·kg－1)[25]；单用多菌灵处理，子实体中多菌灵残留量介于61.13～132.59 μg·kg－1之间，接近或超过欧盟在新鲜菇类中的最大残留限量(0.1 mg·kg－1)，而复配使用多菌灵处理，子实体中多菌灵残留量介于8.12～42.23 μg·kg－1之间，远低于欧盟在新鲜菇类中的最大残留限量(0.1 mg·kg－1)[25]。

表4 复配杀菌剂处理对平菇药剂残留的影响Table 4 The influence of fungicide combinations to the fungicide residue in P. ostreatus

由表5 可知，在袋栽平菇试验中，与CK 相比，单药和复配杀菌剂处理的平菇子实体中粗脂肪的含量未发生显著变化，0.2%复配杀菌剂处理的平菇子实体中粗蛋白和粗多糖的含量均未发生显著变化；使百功＋克霉灵处理不同质量浓度之间平菇的基本营养成分均无显著差异。

3 讨论

在平菇栽培中，现有防治杂菌的措施主要有物理方法和化学方法，化学方法以应用化学杀菌剂为主[26－27]，单一化学杀菌剂的长期连续使用已致使包括尖孢镰刀菌在内的多种食用菌病原菌产生抗性。开发新型杀菌剂或替代药品以缓解病原菌的抗药性显得尤为重要。但新型杀菌剂开发难度大，利用现有杀菌剂进行复配增加药剂的功效并延长其使用寿命，已成为一种切实可行的方法[13]。在植物真菌性病害的防治过程中，已有较多学者针对不同杀菌剂复配的增效作用开展了研究。毕秋艳等[28]研究发现，福美双与啶菌恶唑以5 ∶1的比例进行复配对植物病原菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)具有协同抑制作用。杀菌剂复配协同增效作用的机理，可能与复配药剂增加了靶标位点[29]或分别作用于病原菌的不同生长阶段等[30]有关。

杀菌剂的复配在食用菌栽培中的研究则比较少见。前期研究发现，在平菇栽培中，多菌灵、使百功和克霉灵分别以1 ∶1两两复配时均可显著增加其对根霉菌的抑制效果，复配杀菌剂的防杂增产效果显著优于单药[17]。本研究也发现，多菌灵、使百功和克霉灵以1 ∶1两两复配时均显著增加了其对尖孢镰刀菌的抑制效果。此外，3 种单药对尖孢镰刀菌生长抑制的EC50值均明显小于其对根霉菌生长抑制的EC50值(使百功:112.65 mg·L－1；多菌灵:301.25 mg·L－1；克霉灵:275.31 mg·L－1)，暗示尖孢镰刀菌对这3 种杀菌剂的敏感性均强于根霉菌；本研究中多菌灵和克霉灵单药处理及3 种复配杀菌组合处理对平菇(灰美2 号)生长抑制的EC50值也均显著小于前期研究中其对平菇(德丰5 号)生长抑制的EC50值[17]，说明杀菌剂及其复配组合对不同平菇品种菌丝生长的影响存在一定的差异，在平菇栽培中，需要根据平菇品种确定所用杀菌剂的浓度。多菌灵、使百功和克霉灵两两复配在平菇栽培中的增效作用机理，可能与这3 种杀菌剂在平菇中的靶标位点不同，从而增加了抑菌作用有关。

在药剂试验中，多数研究均忽略了药剂对施用对象营养成分的影响及其在施用对象本身中的残留量。前期研究结果虽表明复配杀菌剂在平菇栽培中的防杂增产效果显著优于单药，但未研究其对平菇营养成分和其在平菇子实体中药剂残留的影响[17]。本研究发现，与未添加药剂的对照相比，使百功＋克霉灵处理在降低平菇袋栽污染率的同时，未显著影响平菇子实体中的粗蛋白、粗脂肪和粗多糖等基本营养成分。此外，平菇栽培中施用相同质量浓度(0.3%)的杀菌剂时，复配杀菌剂处理的平菇子实体中使百功和多菌灵的残留量均显著低于单一杀菌剂的残留量，降幅为68.0%～73.8%，这可能是因为使百功和多菌灵在平菇中的靶标位点和作用机制不同，二者协同使用，增加了抑菌效果，进而降低了复配中单一药剂的使用量。此结果再次证实复配杀菌剂在防杂增产的同时可有效降低平菇子实体中的农药残留量。

4 结论

本研究发现使百功＋克霉灵处理显著抑制了平菇病原菌尖孢镰刀菌的菌丝生长，也显著降低了平菇子实体中的农药残留量，同时未影响平菇子实体的基本营养成分，对平菇的防杂增产效果显著优于单一杀菌剂。使百功与克霉灵复配用于防治平菇枯基病效果最佳。

表5 复配杀菌剂处理对平菇基本营养成分的影响Table 5 The influence of fungicide combinations to the nutritional composition of P. ostreatus