强心一号配方对脓毒症小鼠海马区神经炎症反应的影响

王雪蕊 刘清泉 徐霄龙 白云静 哈雁翔 郭玉红

摘要 目的：探討强心一号配方对脓毒症小鼠认知功能障碍和海马区神经炎症反应的影响。方法：将60只C57BL/6小鼠分为假手术组、模型组、强心组，每组20只。模型组和强心组采取盲肠结扎穿孔术（CLP）制备脓毒症模型。强心组于术后2 h给予强心一号配方灌胃治疗，浓度为1 g/kg体质量，模型组和假手术组分别给予1 mL生理盐水灌胃治疗。术后10 d采用Morris水迷宫实验评价小鼠空间学习记忆能力的变化，酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测小鼠海马组织中炎症介质蛋白表达水平，实时定量PCR检测海马组织炎症介质基因表达水平。结果：与假手术组比较，模型组Morris水迷宫逃避潜伏期和目标象限的时间显著降低，海马组织中白细胞介素1-β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）蛋白和基因表达水平显著增高（P<0.05）;与模型组比较，强心组逃避潜伏期和目标象限时间显著升高，海马组织IL-1β和TNF-α蛋白和基因表达水平显著下降（P<0.05）。各组小鼠Morris水迷宫游泳速度差异无统计学意义（P>0.05）。结论：强心一号配方对CLP小鼠认知功能障碍具有保护作用，其机制可能与减轻海马区神经炎症反应有关。

关键词 脓毒症;中药;强心一号配方;认知功能;水迷宫;海马;炎症介质;神经炎症

Abstract Objective：To investigate the effects of Qiang-xin1 Formula on cognitive dysfunction and neuroinflammation in hippocampus of sepsis mice.Methods：A total of 60 healthy male C57BL/6 mice were selected as the research objects and were randomly divided into a sham group，a model group and a Qiang-xin1 group，with 20 cases in each group.Cecal ligation and puncture （CLP） was used to establish sepsis model in model group and Qiang-xin1 group.Two hours after operation，1g/kg·bw of Qiang-xin1 Formula was orally administrated in the Qiang-xin1 group，and 1 mL of normal saline was orally administrated in the model group and the sham operation group.Morris water maze test was used to evaluate the spatial learning and memory ability in CLP mice 10 days after surgery.ELISA was used to detect the protein levels of inflammatory factors in the hippocampus of mice.Realtime PCR was used to detect the expression of inflammatory factors in the hippocampus.Results：Compared with the sham group，the escape latency and the time in the target quadrant accessed by Morris water maze test were significantly reduced in the model group.The protein and gene levels of IL-1 β，IL-6，TNF-α in the hippocampus were significantly increased （P<0.05） in the model group.Compared with the model group，the escape latency and the time in the target quadrant accessed by Morris water maze test were significantly increased in Qiang-xin1 group （P<0.05）.The protein and gene levels of IL-1β and TNF-α were significantly down-regulated in Qiang-xin1 group （P<0.05）.The swimming speed in the Morris water maze test showed no difference among each groups.Conclusion：Qiang-xin1 Formula has protective effect on cognitive dysfunction in CLP mice，and the mechanism may be related to the reduced neuroinflammation in the hippocampus.

Keywords Sepsis; Chinese Medicinal; Qiang-xin1 Formula; Cognitive function; Morris water maze; Hippocampus; Inflammatory Factor; Neuroinflammation

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.008

脓毒症是指宿主对微生物感染的应答反应失调而导致危及生命的多器官功能障碍[1]，是导致重症监护病房（Intensive Care Unit，ICU）患者死亡的“头号杀手”[2]。脓毒症患者常伴随大脑的局灶性或者弥漫性的功能障碍，出现如注意力缺乏、谵妄、昏迷、认知功能异常等一系列临床综合征，被称为脓毒症相关性脑病（Sepsis-associated Encephalopathy，SAE）。ICU患者中SAE的发病率高达70%以上[3]，SAE是脓毒症患者死亡的危险因素[4]。不仅如此，幸存的脓毒症患者多伴有远期认知障碍、抑郁症、创伤后应激障碍和记忆存储损伤等远期神经系统症状，是导致生命质量下降和医疗成本增加的主要原因[5]。因此，及时有效地预防和治疗SAE对于改善脓毒症患者的生存率和提高生命质量至关重要。本课题组在多年治疗脓毒症的相关经验下，总结明确了强心一号配方对脓毒症小鼠的疗效[6-7]。本研究观察强心一号配方对脓毒症小鼠认知功能损害和海马区神炎症反应的影响，为强心一号配方的临床应用提供理论证据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 本研究所用SPF级动物均采购于北京华阜康生物科技股份有限公司（生产许可证号SCXK（京）2014-0004，使用许可证号：SCXK（京）2015-0023）。动物为C57BL/6J背景小鼠，60只，雄性，鼠龄10～12周，体质量20～23 g，各组小鼠自由进水进食，保持室温恒定，由北京中医医院研究所按纯系动物要求专人饲养。

1.1.2 药物 强心一号配方中药物均由首都医科大学附属北京中医医院中药房提供。组成包括：水红花子30 g、黄芪30 g、茯苓20 g、丹参20 g、五味子10 g。药物煎煮方法同既往文献[6-7]。

1.1.3 试剂与仪器 反转录试剂盒（Promega，美国，批号：A3500），实时定量PCR试剂盒（TaKaRa，日本，批号RR047A），小鼠白细胞介素-6（IL-6，批号：M6000B）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α，批号：MTA00B）和白细胞介素-1β（IL-1β，批号：MLB00C）均购于美国R&D公司，戊巴比妥钠（上海榕柏生物技术有限公司，批号：57-33-0）。Morris水迷宫（Styling，美国，型号：LM-WM0010），Morris水迷宫视频分析系统（Supermaze，美国，型号：XR-XM101），Bio-Rad iQ5实时定量PCR仪（Bio-Rad，美国，型号：ABI7500），台式离心机（BECKMAN，美国，型号：Allegra X-30R），酶标仪（Biotek，美国，型号：ELx808）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 采用随机数字表法将实验动物随机分为假手术组、模型组和强心组，每组20只。模型组和强心组小鼠采用盲肠结扎穿孔术（CLP）复制脓毒症动物模型。采用1%戊巴比妥钠对动物进行腹腔麻醉后，行手术操作，假手术组小鼠行假手术操作，方法同既往文献报道[7-8]。术后各组小鼠自由进水进食，保持室温恒定。

1.2.2 给药方法 强心组于造模后2 h开始给予1 g/kg体质量强心一号配方灌胃，1次/d，时间为每天8：00-10：00，灌胃体积为1 mL。模型组和假手术组于造模术后2 h开始给予1 mL生理盐水灌胃，1次/d，时间为每天8：00-10：00。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 认知功能测定 采用Morris水迷宫试验评价各组小鼠空间学习记忆能力。该试验包括定位航行试验和空间探索试验。水迷宫试验在直径100 cm、高度40 cm的圆形水箱中进行。水温维持在（22±1）℃，分为东北、西北、东南、西南4个象限。一个可移动的隐蔽平台（直径5 cm）被放置在目标象限（东北方向）水面以下0.5 cm的深处。每次调试完设备后，于上午8：30正式开始实验。假手术组、模型组、强心组小鼠各20只，依次进行试验。定位航行试验：各组小鼠于CLP术后第6天开始训练试验，每只老鼠连续训练4 d，每天接受3次训练。给小鼠90 s的时间来寻找平台。小鼠一旦定位到水下平台，就可以在平台上停留10 s。期间摄像自动记录每只小鼠逃避潜伏期和游泳速度。每次訓练试验结束后小鼠被放回笼子里休息10 min后开始下1次训练。空间探索试验：在训练的5 d（CLP术后第10天）通过移除平台进行探索试验，允许小鼠自由游泳90 s，摄像自动记录各小鼠在目标象限的时间。

1.2.3.2 海马组织炎症介质蛋白水平检测 于CLP造模后第10天，采用随机数字表法将检测完Morris水迷宫的假手术组、模型组、强心组小鼠各选出10只。动物麻醉后进行断头处理，小鼠脑组织放于冰盒上并迅速分离海马组织，经液氮快速冷冻后转入-80 ℃保存。采用酶联免疫吸附试验法（ELISA）参照试剂盒步骤对海马组织中炎症介质的水平进行检测。

1.2.3.3 实时荧光定量PCR法检测海马组织炎症介质mRNA表达水平 于CLP造模后第10天，将剩余测完Morris水迷宫的假手术组、模型组、强心组小鼠各10只，采用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，用含有肝素的0.9%氯化钠溶液灌注心脏，然后进行断头处理。小鼠脑组织放于冰盒上并迅速分离海马组织，经液氮快速冷冻后转入-80 ℃保存，待检测。按照说明书利用Trizol法提取细胞总RNA。将总RNA提取、测浓度、反转录后进行实时定量PCR实验。小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α和GAPDH引物均通过Premier3软件设计，引物序列及产物长度同既往文献[7]。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，数据符合正态分布以均数±标准差（±s）表示。Morris水迷宫数据采用多因素重复测量方差分析。其他数据比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠认知功能比较 1）定位航行试验：重复测量方差分析检测时间和分组之间存在交互作用（F=21.3，P<0.01），各组小鼠逃避潜伏期随时间变化差异有统计学意义（F=209.69，P<0.05），逃避潜伏期根据分组变化差异有统计学意义（F=213.59，P<0.05）。与假手术组比较，模型组小鼠逃避潜伏期显著增加（P<0.05）;与模型组比较，强心组大鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.05）。见图1A和表1。各组小鼠的游泳速度差异无统计学意义（P>0.05）。见图1B和表2。2）空间探索试验：与假手术组比较，模型组小鼠在平台所在目标象限时间百分比显著降低（P<0.05）;与模型组比较，强心组小鼠在目标象限时间百分比显著增加（P<0.05）。见图1C。

2.2 各组小鼠海马组织IL-1β、TNF-α和IL-6基因及蛋白表达比较 与假手术组比较，模型组海马组织中炎症介质IL-1β、TNF-α和IL-6的蛋白和基因表达水平均显著增高（P<0.05）;与模型组比较，强心组海马组织中IL-1β和TNF-α的蛋白和基因表达水平显著下降（P<0.05），IL-6的蛋白和基因表达水平没有显著变化。见图2～3。

3 讨论

脓毒症的高致病率和高死亡率一直是全球面临的重大难题，据统计据流行病学统计，全球每年有2 100万脓毒症患者[1]，ICU出院后的脓毒症患者1年病死率高达40%[9]，5年病死率高达80%[10]。SAE患者住院期间都常出现谵妄、烦躁、嗜睡、昏睡等脑功能障碍的临床症状，出院后有较高的失语、抑郁、认知功能障碍的风险。研究表明，脓毒症患者出现情绪及认知功能障碍的概率是正常人的3倍，约25%的脓毒症患者在出院后1年内出现认知障碍，约70%的患者在ICU出院后1年出现认知障碍[11-12]。认知功能障碍不仅影响患者生命质量，同时需要更多的康复治疗及护理[13]，给家庭和社会带来长期的经济负担。寻找有效的改善SAE认知功能障碍的治疗方式具有重大意义。

SAE患者出现神志症状和认知功能障碍，可属中医学“神昏”“痴呆”范畴[14]。本课题组带头人刘清泉教授多年来总结了大量的临床及基础研究工作，提出了“外来之毒与内生毒邪互结”是脓毒症的主要病因，“正虚毒损，络脉闭阻”是基本病机[15]。SAE的发生是由于热毒、痰浊、瘀血互结于心脑清窍，而致气机逆乱，蒙蔽心神。其病位在脑，与心、肝、脾、肾皆相关。本病以气血、肾精亏虚为本，痰浊、瘀血为标，临床多见虚实夹杂之证，“扶正解毒通络”应为其主要治则[16]。强心一号配方中黄芪补气升阳、养血益中;茯苓宁心安神、益气生津;丹参通络活血;水红花子利水化痰消积;五味子养阴益气、镇惊安神。我们前期研究发现，强心一号配方对于可以显著降低脓毒症小鼠的死亡率[6]。在本研究中，我们利用评价小动物空间学习记忆能力的“金标准”Morris水迷宫检测强心一号配方对SAE认知功能障碍的改善作用。各组小鼠的游泳速度差异无统计学意义，说明CLP造模和强心一号配方干预对小鼠运动功能没有影响。定位航向试验和空间探索试验结果发现，强心一号配方可以显著提高脓毒症小鼠的逃避潜伏期和象限时间百分比，说明强心一号配方对脓毒症小鼠的空间学习记忆能力具有一定改善作用。

大腦海马体是与人类的学习记忆等高级功能有密切关系的重要功能区，是脑内参与学习、记忆、认知和突触可塑性的重要部分。研究表明，海马区的过度神经炎症反应是导致SAE认知功能障碍的重要原因之一[17-18]。脓毒症发生时，血脑屏障的破坏会导致循环中的细胞因子和免疫炎症细胞浸润至深部脑区;脑区中的细胞因子激活细胞表面的模式识别受体，进一步放大炎症反应。过度的炎症反应引起小胶质细胞激活、神经元细胞凋亡、氧化应激等病理生理学过程，导致认知功能障碍[19]。研究发现，与正常人比较，SAE患者海马区IL-6等炎症介质表达显著升高[20]。在脓毒症动物模型中，造模6 h内即可观察到炎症介质TNF-α、IL-1β和IL-6等表达的升高，并持续升高至造模后10～30 d[21-22]。既往研究表明，炎症介质的升高与脓毒症认知功能障碍的严重程度和死亡率的升高成正相关[23-24]。本研究发现，在CLP术后10 d，模型组海马组织中炎症介质IL-1β、TNF-α和IL-6表达水平显著增高，强心一号配方可显著改善炎症介质IL-1β和TNF-α的表达水平。说明强心一号配方改善SAE认知功能障碍的机制可能与降低海马组织神经炎症反应有关。

但是，强心一号配方是否是通过改善突触可塑性、减少神经元细胞凋亡、降低小胶质细胞激活等分子机制来改善脓毒症认知功能障碍，仍需要进一步研究。

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（2019-12-13收稿 責任编辑：王明）