益气温阳法联合顺铂对荷瘤小鼠调节性T细胞的影响

张召杨 孙增涛 王霖

摘要 目的：研究益氣温阳法联合顺铂对Lewis肺癌小鼠调节性T（T Regulatory，Treg）细胞的影响。方法：建立40只近交系C57BL/6纯系雄性小鼠Lewis肺癌细胞皮下移植瘤模型后，将40只造模后的小鼠随机分为模型组、中药组、顺铂组及联合用药组，每组10只，单笼饲养。模型组以0.4 mL生理盐水连续灌胃12 d;中药组以0.4 mL中药液连续灌胃12 d（20 g生药/kg）;顺铂组以0.2 mL顺铂溶液腹腔注射，分别在第1天、第3天、第5天腹腔注射顺铂溶液（4 mg顺铂/kg）;联合用药组以0.4 mL中药液连续灌胃12 d（20 g生药/kg），在第1天、第3天、第5天腹腔注射顺铂溶液0.2 mL（4 mg顺铂/kg）。给予药物干预12 d后，用流式细胞术检测各组小鼠脾脏组织Treg细胞的比例。结果：流式细胞术结果表明，益气温阳法治疗可显著降低Lewis肺癌小鼠脾脏组织Treg细胞，与模型组比较，中药组、顺铂组和联合用药组小鼠脾脏组织内CD4+CD25+Treg细胞比例与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例均显著降低（P<0.05）。结论：益气温阳法通过降低Treg细胞的水平增强机体的抗肿瘤免疫应答而发挥抑瘤作用。

关键词 肺癌;益气温阳法;调节性T细胞;自身免疫;转录因子Foxp3;CD4+CD25+Treg细胞;D4+CD25+Foxp3+Treg细胞

Abstract Objective：To study the effects of Yiqi Wenyang method combined with cisplatin on T regulatory cell （Treg） of Lewis lung cancer mice.Methods：After 40 inbred C57BL/6 male mice with Lewis lung cancer cell transplanted subcutaneously were established，They were randomly divided into model group，traditional Chinese medicine group，cisplatin group and combined drug group，10 in each group，fed in single cage.The model group was given 0.4 mL saline for 12 days;In the traditional Chinese medicine group，0.4 mL of traditional Chinese medicine solution was infused into the stomach for 12 days （20 g crude drug/kg）;In cisplatin group，0.2 mL cisplatin solution was intraperitoneally injected，and cisplatin solution （4 mg cisplatin/kg） was intraperitoneally injected on the first day，the third day and the fifth day respectively;In the combined group，0.4 mL traditional Chinese medicine solution was infused into the stomach for 12 days （20 g crude drug/kg），and 0.2 mL cisplatin solution （4 mg cisplatin/kg） was injected intraperitoneally on the first day，the third day and the fifth day.After 12 days of drug intervention，the proportion of Treg cells in spleen tissue of mice in each group was detected by flow cytometry.Results：the results of flow cytometry showed that the treatment of Yiqi Wenyang method could significantly reduce the spleen Treg cells of Lewis lung cancer mice.Compared with the model group，the number of the proportion of CD4+CD25+ Treg cells and the proportion of CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells in spleen tissue of mice in the traditional Chinese medicine group，cisplatin group and combination group were significantly reduced （P<0.05）.Conclusion：the method of Supplementing Qi and warming yang can inhibit tumor by reducing the level of Treg cells and enhancing the anti-tumor immune response.

Keywords Lung cancer; Yiqi Wenyang method; Regulatory T cells; Autoimmunity; Transcription factor Foxp3; CD4+CD25+ Treg cells; D4+CD25+Foxp3+ Treg cells

中图分类号：R273;R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.010

肺癌屬恶性肿瘤之一，并且其发生率与死亡率在恶性肿瘤排名第一，严重威胁人类生命健康，成为我们亟待解决的问题[1]。它的发生、发展与机体自身免疫机制密不可分。调节性T细胞（Treg细胞）是体内调节自身免疫的一类T细胞亚群，具有抑制免疫细胞介导的免疫反应及组织微环境中特定非免疫细胞的代谢及增殖等生理功能，并且精确调控机体免疫应答水平以维持机体的免疫耐受状态[2]。其中CD4+CD25+调节性T细胞虽然仅占CD4+T细胞的5%～10%，但其作为天然的调节细胞，在建立自身免疫耐受及免疫平衡等方面起着重要作用，是免疫系统不可缺少的重要组成部分，也对多种非自身组织的抗原发生免疫反应[3]。转录因子Foxp3是Treg细胞的特异性核转录因子，也是CD4+CD25+Treg细胞发育和功能维持的主要调节基因[4]。CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞为主的抑制性T细胞在肺癌免疫抑制中占主导地位[5]。单纯的化疗药物疗法疗效佳，但易产生耐药性，需要联合中医治疗。本研究通过检测Lewis肺癌小鼠脾脏组织中Treg细胞的数量探讨益气温阳法治疗小鼠Lewis肺癌的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取近交系C57BL/6纯系小鼠40只，雄性，体质量（18.0±2.0）g，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号：SYXK（津）2019-0002。动物级别：清洁级别，培养在室温（25±2）℃室内，每日日照时间达到12 h，室内通风良好，湿度40%～60%，给予足量饲料及自由饮水。实验操作符合动物福利伦理要求（伦理审批号：IRM-DWLL-2019140）。

1.1.2 药物 中药复方益气温阳方由黄芪、肉苁蓉、淫羊藿、党参、莪术、鸡内金、桔梗、甘草等10味中药组成，方药选取及制备由天津中医药大学第二附属医院药房将药物制成颗粒剂，用蒸馏水配制成含生药0.1 g/mL的药液置于4 ℃冰箱中保存。顺铂注射液（齐鲁制药有限公司，生产批号：8K029A89）10 mg/支，用生理盐水配制含顺铂0.4 mg/mL的药液供实验用。

1.1.3 试剂与仪器 胎牛血清（HyClone，美国，批号：AF29498419），1640培养基（Gibco，美国，批号：8120386），FITC标记的抗小鼠CD4MsAb（美国BD，美国，批号：561828），BB700标记的抗小鼠CD25MsAb（美国BD，美国，批号：566499），APC标记的抗小鼠Foxp3MsAb（美国BD，美国，批号：563486），Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Kit（MultiSciences，批号：70-IC001-100），CO2细胞培养箱（日本Sanyo公司，日本，型号：MCO-175），光学显微镜（日本Nikon，日本，型号：ECLIPSETS100），流式细胞分析仪（美国BD，美国，型号：Accuri C6），离心机（北京新时代北利医疗器械有限公司，型号：GTR16-2）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 1）分组：C57BL/6小鼠接种后，并随机分为4组，每组10只，分别为模型组、顺铂组、中药组与联合用药组。2）细胞培养：小鼠Lewis肺癌瘤株购于中国科学院上海生命科学研究院，置于液氮罐中冻存。细胞复苏时取小鼠Lewis肺癌瘤株于37 ℃水浴融化，加入RPMI1640完全培养液（90% 1640培养液+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素），在37 ℃，5% CO2培养箱中常规培养，次日换液，待融化80%左右时用胰酶消化传代，3 d传代1次。3）模型制备：将培养后的Lewis细胞用胰蛋白酶消化，传代后，待细胞达到所需量时，显微镜下计数，调整细胞约1×107个/mL。每只小鼠接种前，充分摇匀瘤细胞悬液，取瘤细胞悬液0.2 mL于小鼠右腋窝皮下接种，在30 min内接种完毕。以接种后第2～9天于小鼠右腋皮下触摸到肿瘤结节（肿瘤平均直径达到约5 mm）为建模成功，将动物随机分组开始给药。

1.2.2 给药方法 模型组以0.4 mL生理盐水连续灌胃12 d;顺铂组于第1、3、5天以0.2 mL/只腹腔注射顺铂注射液（4 mg顺铂/kg）;中药组连续灌胃12 d灌胃益气温阳方（20 g生药/kg）0.4 mL/只;联合用药组：连续灌胃12 d灌胃益气温阳方（20 g生药/kg）0.4 mL/只，同时第1、3、5天腹腔注射顺铂注射液（4 mg顺铂/kg）0.2 mL/只。取材前1 d禁食，将各组小鼠颈椎脱臼处死后无菌取其脾脏组织。

1.2.3 检测指标与方法 通过流式细胞分析仪检测脾脏CD4+CD25+Treg细胞及CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例。将小鼠颈椎脱臼处死，收取脾脏，制备细胞悬液;收集细胞悬液，过滤至离心管中;于4 ℃，加入磷酸缓盐冲液（PBS）洗涤1次，1 000 r/min，离心半径9 cm，离心5 min，用染色缓冲液调整细胞为1×107/mL。取100 μL细胞悬液，加入CD4抗体和CD25抗体，轻弹混匀。避光，4 ℃，30 min。加入2 mL红细胞裂解液，裂解5 min。然后加入2倍以上体积的PBS，终止裂解。4 ℃，1 000 r/min，离心半径9 cm，离心5 min。用流式染色液洗，室温1 000 r/min，离心半径9 cm，离心5 min，重复2遍。最后1次离心后，完全弃上清。加1 mL Foxp3固定/渗透液工作液（固定/渗透浓缩液和固定/渗透稀释液以1∶3的比例混合），涡旋固定细胞。4 ℃避光孵育60 min。每管加2 mL 1×渗透缓冲液。室温，1 000 r/min，离心半径9 cm，离心5 min，弃上清。加100 μL渗透缓冲液1×重悬细胞后，加入Foxp3抗体，室温避光孵育30 min。2 mL 1×渗透缓冲液洗1次，室温，1 000 r/min，离心半径9 cm，离心5 min，弃上清。适量流式染色液重悬，上机检测，用Flowjo获取并分析数据，分别观察CD4+细胞数、CD4+CD25+Treg细胞与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞之间的比例关系。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料用均數±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齐时选用LSD法，方差不齐时选Dunnett-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组小鼠CD4+CD25+Treg与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例比较，单因素方差分析结果显示：与模型组比较，中药组、顺铂组和联合用药组小鼠CD4+CD25+Treg细胞比例与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例均显著降低，差异均有统计学意义（均P<0.05）;与顺铂组比较，联合用药组CD4+CD25+Treg细胞比例显著下降，差异均有统计学意义（均P<0.05），中药组CD4+CD25+Treg细胞比例差异无统计学意义;与顺铂组比较，联合用药组与中药组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例均显著降低，差异均有统计学意义（均P<0.05）。见表1，图1。

3 讨论

肺癌的发生、发展、转移及预后与免疫逃逸机制有很强的相关性。机体免疫系统可以识别清除恶性细胞，而肿瘤细胞可以通过Tregs逃避免疫识别和免疫监视，导致肿瘤免疫耐受[6]，从而促进肿瘤的发展。肺癌在中医学方面归属于学“肺积”“喘息”“胸痛”“咳嗽”“咯血”等范畴，中医认为肺癌多是因虚致病，患者机体正气虚，亦指机体免疫功能低下，无力抗邪，邪气日益亢盛，肿瘤逐渐增大、转移。中医学强调整体观念，基本治疗原则是扶正祛邪，通过中药一方面增强机体免疫能力[7-8]，抑制肿瘤生长，减轻化疗的不良反应，另一方面提高免疫因子的免疫识别和免疫监视能力，减少免疫逃逸。

调节性T细胞具有维持机体免疫耐受的功能，在机体免疫系统中发挥着重要的免疫保护功能，起着维持机体免疫功能稳定的重要作用，与肿瘤免疫相关[9]。在此方面，Treg细胞是一群具有促肿瘤免疫耐受和免疫逃逸的负调节细胞亚群，且其在多种肿瘤中均表现明显的负向调控作用[10]。肿瘤细胞可诱导机体产生Treg细胞，而Treg细胞在肿瘤微环境中进一步发挥免疫抑制作用。CD4+CD25+Treg细胞是效应性T细胞的重要组成成分，在免疫调节过程中发挥重要作用。研究显示，CD4+CD25+Treg细胞抑制抗肿瘤免疫应答，促进免疫逃逸进而促进多种肿瘤的发生发展，包括肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等[11]。周奕辰和王金岩[12]通过小鼠Lewis肺癌实验发现CD4+CD25+Treg细胞可通过多种机制加速肿瘤进展。Fxop3表面分子是叉头翼状螺旋转录因子的总称，特异性表达于Treg细胞上，是Treg细胞的一个特异性标志，Foxp3可以显著抑制机体的免疫反应[13]。刘瑞敏等[14]研究发现肿瘤细胞中存在着高表达的Foxp3，而高表达Foxp3的肺癌细胞可能通过表达细胞因子改变局部生长的微环境，逃逸免疫监视，而促进肿瘤细胞的成瘤和生长。Foxp3不仅对CD4+CD25+Treg细胞的活化有影响，而且对Treg细胞的发育和抑制也起一定作用[15-16]。在胸腺、脾脏和淋巴结等淋巴器官及淋巴组织中的CD4+CD25+Treg细胞表面均能够特异性表达。CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞基因突变会导致Treg细胞发育和功能受损，发生免疫调节紊乱[17]。CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞参与肿瘤局部的免疫反应，肿瘤微环境中Treg细胞数量增多，使得免疫调节网络得到激活并抑制机体的抗肿瘤免疫应答，因而导致了肿瘤免疫逃逸，促进了肿瘤的局部侵袭和远处转移。

中医在治疗肿瘤方面有着其独特的优势，研究表明中药及其有效成分通过下调Treg细胞的比例与活性、抑制Foxp3及相关的抗免疫细胞因子的分泌，调节细胞比例从而降低Treg细胞的免疫抑制作用，增强机体免疫应答，逆转肿瘤免疫逃逸，增强机体抗肿瘤活性，抑制肿瘤生长，改善患者的生命质量，延长患者生存时间[18]。除对癌细胞的直接杀伤杀灭作用外，中药还能通过抑制癌细胞增殖分化，缓解化疗疗法不良反应，抑制肿瘤发展转移，降低多种西药耐药性和增强机体免疫功能等而发挥其抗肿瘤作用[19]。益气温阳法是孙增涛教授总结临床经验所得，方以黄芪补中气、固表气、升阳举陷与党参补益脾肺之气，二者共为君药，主以益气补脾，臣以肉苁蓉与淫羊藿温阳益肾;君臣共济，益气温阳，寓攻于补，增强机体免疫力;最后佐以莪术、鸡内金、桔梗、甘草等药，化瘀通滞，破血消癥，以达到消瘤之效，使机体补而不滞，攻而不破。综合全方攻补兼施，机体得以生养。在现代药理实验中发现益气温阳类药物均对肿瘤具有抑制作用。Zhang等[20]研究发现黄芪提取物黄芪甲苷能够抑制Lewis小鼠体内肺癌细胞的生长与转移，其作用是通过下调Treg细胞比例。现代药理研究发现党参具有抗肿瘤和提高机体免疫能力的作用[21-23]。范亚楠等[24]发现无论是生肉苁蓉还是炮制后的肉苁蓉均具有提高机体免疫的功能。相关药理实验亦证实淫羊藿醇提物可能通过提高免疫调节能力的作用对肺癌产生明显的抑制作用[25]。

杨国良等[26]通过实验观察发现益气养阴方可能通过降低肿瘤组织Foxp3 mRNA的表达，减少CD4+CD25+Treg细胞分化，进行改善细胞免疫抑制状态，从而抑制肿瘤的生长，且联合治疗较单纯化疗、单纯益气养阴治疗有更好的疗效。梁启军等[27]发现益气清毒法治疗肺癌基础方及其防癌茶抑瘤效果良好，其抗癌机制与增强杀伤性免疫细胞的免疫力和减轻CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞等免疫抑制细胞的免疫抑制有关。林颖等[28]动物实验研究发现，使用补肾益肺解毒法中药干预Lewis肺癌小鼠后，可显著降低小鼠外周血和移植瘤CD4+CD25+Treg细胞、Foxp3的水平，表明中医补肾益肺解毒法通过降低CD4+CD25+Treg细胞比例、下调Foxp3的表达水平，从而达到提高机体的抗肿瘤免疫应答作用，进而发挥抑瘤作用。

因此，研究CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在肺癌中的作用对防治肺癌的转移、复发具有重要作用。本研究发现益气温阳中药对Lewis肺癌小鼠进行干预后，采用流式细胞术检测Lewis肺癌小鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例，小鼠脾脏中CD4+CD25+Treg细胞与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例明显下降。与化疗组比较，中药方联合化疗运用时其降低各项指标作用更为显著，差异有统计学意义;与化疗药比较，中药组可以明显下调CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例，差异有统计学意义，可见中药方对于下调Lewis肺癌小鼠水平有较好的作用。中药和化疗对降低Lewis肺癌小鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例具有协同作用，这表明益气温阳方可以有效抑制肿瘤相关指标，提高机体免疫功能。在临床上，我们可以通过降低CD4+CD25+Treg细胞比例和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例，避免机体的免疫抑制，延长患者生存期，这对于临床具有重大意义。

综上所述，益气温阳方在抑制Lewis肺癌小鼠移植瘤生长、延长小鼠生存期、降低CD4+CD25+Treg细胞与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例与顺铂组差异无统计学意义，可能通过降低小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例来增强机体的抗肿瘤免疫应答，以达到治疗肿瘤的目的。

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（2020-06-30收稿 责任编辑：王明）