基于转录组测序技术探讨活血降糖饮干预糖尿病肾病的机制

刘雪梅 刘德亮 曾霖 李惠林 赵恒侠 张学文

摘要 目的：探讨活血降糖饮治疗糖尿病肾病的分子机制。方法：通过高脂饲料喂养加尾静脉注射链脉佐菌素（STZ）等建立糖尿病肾病大鼠模型，并将模型大鼠随机分为糖尿病肾病（DN）组、模型+双胍+中药组（DN+Met+ZY）、模型+双胍+卡托普利组（DN+Met+CP），给予相应药物进行灌胃治疗，并另设正常对照组，每组10只，干预16周后，观察各组大鼠空腹血糖（FBG）、血脂、血清尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、24 h尿总蛋白（24 h UTP）及尿微量清蛋白（24 h mALB）的变化。观察肾组织病理改变，并对各组肾组织进行RNA-seq测序。结果：与模型组比较，中药组和卡托普利组可以显著下调糖尿病肾病大鼠FBG、TC、TG、LDL-C、Scr、BUN、24 h UTP、24 h mALB等水平，而HDL-C无明显变化;与卡托普利组之间比较，中藥组FBG、TC、TG、LDL-C明显下降，HDL-c、Scr、BUN、24 h UTP、24 h mALB均无明显差别。与模型组比较，中药组和卡托普利组均可以显著改善糖尿病肾病大鼠的肾脏病理学变化。转录组测序结果显示模型组对比正常组与中药组对比模型组转录本中基因总量接近，其中表达差异最明显的双向调控基因共筛选出10个;京都基因与基因组百科全书（KEGG）前20条显著富集通路分析显示模型组对比正常组与中药组对比模型组共同作用的信号通路有代谢相关通路及cAMP信号通路。结论：活血降糖饮联合二甲双胍能改善糖尿病肾病大鼠的糖脂代谢紊乱，减少尿白蛋白的排泄，改善肾功能和肾脏病理改变，延缓糖尿病肾病病情进展，其作用机制可能是通过Cftr、Pdk4、Angptl4、Hmgcs2等多靶点介导多通路实现的。

关键词 活血降糖饮;糖尿病肾病;转录组测序技术;二甲双胍;糖尿病;链脲佐菌素;卡托普利

Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Huoxue Jiangtang Decoction in the treatment of diabetic nephropathy.Methods：The diabetic nephropathy model was established by feeding high fat diet and injecting streptozotocin （STZ） through tail vein.The model rats were randomly divided into a diabetic nephropathy （DN） group，a model+biguanide+traditional Chinese medicine （DN+Met+ZY） model+biguanide+captopril （DN+Met+CP） group.The corresponding drugs were given by gavage，and another normal control group was set up，with 10 rats in each group.The changes of fasting blood glucose （FBG），blood lipid，serum urea nitrogen （BUN），serum creatinine （SCR），24 h urinary protein （24 h UTP） and urinary microalbumin （24h mAlb） were observed.The pathological changes of renal tissue were observed，and RNA-seq sequencing was performed in each group.Results：Compared with the model group，the levels of FBG，TC，TG，LDL-C，SCR，bun，24 h UTP and 24 h mAlb were significantly decreased in the Chinese medicine group and captopril group，but HDL-C had no significant change; compared with captopril group，FBG，TC，TG and LDL-C in Chinese medicine group decreased significantly，while there were no significant difference in HDL-C，SCR，bun，24 h UTP and 24 h mAlb.Compared with the model group，the Chinese medicine group and captopril group can significantly improve the renal pathological changes of diabetic nephropathy rats.The results of transcriptome sequencing showed that the total number of genes in the transcripts of model group vs normal group and traditional Chinese medicine group vs model group was close，and 10 bidirectional regulatory genes with the most obvious expression difference were screened out; the analysis of the first 20 KEGG rich pathways showed that the metabolic pathway and cAMP signaling pathway were involved in the model group vs the normal group and the Chinese medicine group vs the model group.Conclusion：Huoxue Jiangtang Drink combined with metformin can improve the disorder of glucose and lipid metabolism，reduce the excretion of urinary albumin，improve renal function and pathological changes，and delay the progression of diabetic nephropathy.Its mechanism may be mediated by multiple pathways such as CFTR，PDK4，ANGPTL4 and hmgcs2 etc.

Keywords Huoxue Jiangtang Decoction; Diabetic nephropathy; Transcriptome sequencing technology; Metformin; Diabetes; Streptozotocin;Captopril

中图分类号：R255.4;R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.012

糖尿病是一种常见的内分泌代谢异常性疾病，以持续性高血糖为特征，是到目前为止影响人类健康的一大慢性非传染性疾病。其发病率随着生活水平的不断提高而逐步上升。而糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病最严重的微血管并发症之一，在糖尿病患者中的发病率为20%～40%[1]，是导致终末期肾衰竭最常见的原因。DN发病机制复杂，至今仍未明了，是多因素共同作用的结果，所导致的主要病理改变为肾脏肥大、肾小球和肾小管基底膜（GBM）增厚、细胞外基质（ECM）蛋白积聚致系膜区扩张，最终导致弥漫性或结节性肾小球硬化及肾小管间质纤维化。目前对于DN的研究认为，其发病可能与以下几个机制有关：1）糖代谢异常导致的多元醇通路激活、蛋白激酶C的活化以及糖基化终产物的形成和堆积，导致早期肾小球高滤过、后期肾小球硬化[2-3];2）高糖引起高渗透压导致肾血流量改变，肾小球内皮细胞和上皮细胞损伤，AngⅡ、TGF-β过度表达，导致细胞外基质增加，肾小球硬化[4];3）糖尿病时，体内多种炎症介质导致肾小球损伤、加速肾小球硬化[5-6];4）其他因素包括氧化应激、细胞凋亡、黏附分子等都参与DN的发生发展全过程。

目前治疗DN主要是通过生活方式的改变以及控制血糖、血脂、血压等加重DN病情的危险因素，并采用血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）降低肾小球压力以减少蛋白尿的生成，而并无特效药物。因此，寻求更多DN的治疗方法实有必要。前期研究发现活血降糖饮能改善糖脂代谢及胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性，同时还能改善肾功能，缓解DN进展[7-9]。本研究初步探讨活血降糖饮对气阴两虚夹瘀型早期DN的可能作用机制;通过基础研究发现活血降糖饮能有效干预DN的生物信息学证据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取健康SPF级Wistar雄性大鼠，4周龄，共40只，体质量（170±10）g，均由中山大学动物中心，动物许可证号SCXK（粤）2016-0029。动物自由摄食、饮水，标准实验环境下饲养。普通饮水和基础饲料均由广州永诺生物科技有限公司提供。本研究已通过广东省深圳市中医院伦理审查[伦理审批号：伦理发（2020年）8号]。

1.1.2 药物 活血降糖饮（黄芪、太子参、丹参各30 g，牡丹皮、红花、山药各10 g，生地黄20 g，五味子、麦冬、黄精、熟大黄各15 g）由深圳市中医院制剂室协助煎煮、过滤，浓缩成含生药4 g/mL，4 ℃冰箱保存备用。二甲双胍为上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产的原料药，用灭菌注射用水配制为25 mg/mL的溶液;卡托普利为上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产的原料药，用灭菌注射用水配制为1.75 mg/mL的溶液。

1.3 试剂与仪器 血糖试剂（批号：SBJ-R0122）、血脂试剂（批号：SBJ-R0794）、尿素氮试剂（批号：SBJ-H2001）、肌酐（批号：SBJ-H1998）等试剂盒均购自罗氏公司;链脲佐菌素（美国Sigma公司，美国，货号：S0130）;磷酸盐缓冲液（PBS）（博士德公司，货号：AR0194-10）;柠檬酸盐缓冲液（批号：Q101977）、二甲苯（批号：2650-17-1）、无水乙醇（批号：E111963）、氯仿（批号：67-66-3）、异丙醇（批号：67-63-0）均购自广州化学试剂厂;苏木精染色液（广州市秀威贸易有限公司，货号：SY1438）;糖原PAS染色液试剂盒（批号：20170925）、Masson三色染色试剂盒（批号：G1340）均购自Solarbio公司;Trizol（美国MRC公司，美国，货号：TR118-100）。血糖仪（强生公司，美国，型号：稳择易ONETOUCH）;全自动生化分析仪（罗氏公司，美国，型号：cobas 8000 c702）;显微镜OPTEC CCD TP510（奥特公司，美国，型号：OPTEC）;冷冻离心机（德国Eppendorf公司，德国，型号：5424R）;干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司，型号：GY-2101）;微量定量检测仪（杭州奥盛仪器有限公司，型号：000001）;电泳仪（上海天能仪器有限公司，型号：EPS 600）;水平电泳槽（北京六一仪器有限公司，型号：DYCP-31A型）;凝胶成像系统（上海天能仪器有限公司，型号：Tanon-5200Multi）;2100生物分析仪（中国Agilent公司，型号：Agilent2100）;PCR仪（中国东胜龙仪器有限公司，型号：ETC811）;迷你离心机（杭州奥盛仪器有限公司，型号：Mini-15k）;涡旋振荡器（杭州奥盛仪器有限公司，型号：MTV-1）;电子显微镜（上海易汇生物科技有限公司，型号：XTX-3C/NTB-2B）;电子显微镜（日本电子株式会社，日本，型号：JEM-1400 PLUS）;冰箱（Thermo公司，美国，型号：Thermo Scientific-80 ℃）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 大鼠普通饲料适应性喂养1周后，称体质量，随机取10只作为正常组，制备模型大鼠30只。模型大鼠持续高脂喂养，正常组大鼠普通饲料喂养，4周后，模型大鼠尾静脉注射链脲佐菌素（STZ）（30 mg/kg）（溶于0.1 mmol/L的柠檬酸缓冲液，现配现用），正常组大鼠尾静脉注射等体积的柠檬酸缓冲液。1周后，所有大鼠禁食12 h，麻醉后眼眶后静脉丛采血测空腹血糖（FBG）。FBG>16.7 mmol/L者，且按上述喂养方法2周后同样方法再次测FBG>16.7 mmol/L则認为造模成功。

1.2.2 给药方法 造模成功后，模型大鼠分为3组（每组10只）和正常大鼠10只，共有如下4组：1）正常组（Control）;2）模型组（DN）;3）模型+二甲双胍+中药（DN+Met+ZY）;4）模型+二甲双胍+卡托普利组（DN+Met+Cap）。中药按4 g/（kg·d）、二甲双胍按250 mg/（kg·d）、卡托普利按17.5 mg/（kg·d）灌胃给药，每周灌胃6 d，1次/d，期间正常喂食，记录各组大鼠体质量、进食量、饮水量等变化，给药16周后，监测大鼠的FBG、24 h尿蛋白（24 h UTP）含量;1周后，禁食24 h，所有大鼠腹主动脉采血后处死，收集血液、两侧肾皮质。及尿微量清蛋白（24 h mALB）。

1.2.3 观察指标与方法

1.2.3.1 一般生化指标检测 各组大鼠腹主动脉采血，收集血液样本离心、取血清，用酶法及胆固醇氧化酶法检测FBG、血脂代谢指标（TC、TG、LDL-C、HDL-C）以及血清尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr），并在罗氏全自动生化分析仪上进行检测。24 h UTP及24 h mALB均用免疫比浊法。

1.2.3.2 观察肾皮质病理的改变 取一侧肾皮质，分为2部分，其中一部分肾皮质在固定、石蜡包埋后，进行HE染色、PAS染色、Masson染色，观察病理改变。

1.2.3.3 观察肾小球超微结构的改变 另一部分肾皮质通过透射电镜观察肾小球超微结构的改变。用锋利刀片切取目标病变部位的肾皮质组织块约1 mm3，不超米粒样大小，经2.5%中性戊二醛溶液前固定2 h、0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗、1%锇酸后固定1.5～2 h、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗、梯度脱水、树脂渗透、包埋、固化、半薄切片定位、超薄切片、铀铅双染色等各步骤后，用电子显微镜观察目标结构、调试电镜至图像清晰，采集需要的图像。

1.2.3.4 RNA-seq测序

选择正常组、模型组、模型+二甲双胍+中药组3组的另一侧肾皮质组织置-80 ℃冰箱，进行RNA-seq测序。

1.2.3.4.1 组织细胞Total RNA的提取 取样本25～50 mg，于研钵中液氮研磨成为粉末，转移至预先加入1 mL Trizol 1.5 mL EP管内，迅速颠倒混匀。弃培养基，加入适量1×PBS（2 mL/25 mm 2培养瓶）洗涤细胞1遍。弃1×PBS，加入1 mL Trizol，反复吹打培养瓶底部以使细胞裂解脱落，收集于1.5 mL离心管，用力震荡混匀。加入200 μL氯仿，上下用力颠倒混匀30 s，静置3 min。4 ℃，12 000×g离心15 min。此时可见裂解液分3层：上层水相的RNA;中层为DNA、脂类等;下层为细胞残渣、蛋白、多糖等。取上清500 μL到新的EP管内，167 μL吸3次;加入等体积的异丙醇，混匀，静置10 min后，4 ℃，12 000×g离心10 min。小心去掉上清，注意不要丢失RNA沉淀，加入1 mL 75%乙醇，上下颠倒，使沉淀块重悬起。4 ℃，12 000×g离心10 min，小心去掉上清，尽量吸干管壁的液体，注意不要丢失RNA沉淀，若沉淀松动可再次离心。晾干约15 min，至管壁无液体。加入适量体积（20～100 μL）的DEPC-H2O溶解RNA，58 ℃水浴10 min。取样1 μL进行分光光度计检测，500 ng进行琼脂糖凝胶电泳检测，500 ng进行安捷伦2100生物分析仪检测，剩余Total RNA样本置于-80 ℃保存。

1.2.3.4.2 mRNA建库 经RNA提取、mRNA分离及片段化、一链cDNA合成、二链合成、二链产物纯化、末端修复与加dA尾、Adapter连接、连接产物纯化、片段选择、PCR、PCR产物纯化后建立mRNA库。

1.2.3.4.3 Illumina HiSeqTM2000测序 由Illumina HiSeqTM2000测序得到数据Raw Reads，随后要对Raw Reads进行质量控制（QC），以确定测序数据是否适用于后续分析，质控后，经过滤得到Clean Reads，用比对软件将Clean Reads比对到参考序列。比对完，通过统计Reads在参考序列上的分布情况及覆盖度，判断比对结果是否通过第2次质量控制（QC of alignment）。

1.2.3.5 基因表达量和差异表达基因分析 运用SOAP[10]软件将通过检测的这些Clean Reads高效、准确地比对到大鼠参考基因组序列上去，并用RSEM软件计算每个基因的表达量，采用基于泊松分布原理的PossionDis法筛选差异表达基因[11]。

1.2.3.6 生物信息学分析 选择大鼠肾皮质组织不同样本间差异表达的基因进行基因功能（GO）富集分析和信号通路（Pathway）富集分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，多组间均值比较采用单因素方差分析，先行方差齐性检验，方差齐采用F检验进行总均值比较、SNK法进行两两比较;方差不齐改用Welch检验进行总体均值比较、Dunnett-t检验进行两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般生化指标检测结果

2.1.1 各组大鼠糖脂代谢指标的比较 与正常组比较，模型组大鼠的FBG、TG、TC、LDL-C等水平显著上升（P<0.01），而HDL-C则显著下降（P<0.01）;与模型组比较，模型+双胍+中药组和模型+双胍+卡托普利组的FBG、TG、TC、LDL-C等水平显著下降（P<0.01），而HDL-C水平则无显著变化。见表1。

2.1.2 各组大鼠肾脏相关指标的比较 与正常组比较，模型组大鼠的Scr、BUN、24 h UTP、24 h mALB等水平显著上升（P<0.01）;与模型组比较，模型+双胍+中药组和模型+双胍+卡托普利组的Scr、BUN、24 h UTP、24 h mALB等水平显著上升（P<0.01）。見表2。

2.2 大鼠肾皮质HE染色、PAS染色、Masson染色结果 1）HE染色主要看组织结构的完整性以及病理情况，其结果显示：正常组肾组织结构排列紧密，肾小球、肾小管形体结构正常;模型组肾脏病变明显，肾小球基底膜增厚，胞外基质、系膜基质积聚。各给药组（DN+Met+ZY、DN+Met+Cap）较模型组病理变化有所改善，给药各组之间变化不明显。2）Masson染色主要看组织发生纤维化程度，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色，其结果显示：正常组肾组织中无明显蓝色，即存在极少量的胶原纤维。模型组存在较多胶原纤维，说明DN促使肾组织发生纤维化。各给药组（DN+Met+ZY、DN+Met+Cap）肾组织的胶原纤维较模型组少，给药组之间肾组织胶原纤维表达无差别。3）PAS染色是观察肾脏结构，尤其是肾小球系膜、基底膜以及肾小管结构的主要方法，紫红色深浅代表糖原或多糖的含量高低，其结果显示：模型组肾组织多糖和糖原表达比正常组表达明显增加，呈紫红色。各给药组（DN+Met+ZY、DN+Met+Cap）肾组织多糖或糖原的表达均比模型组表达量减少，给药组之间肾组织多糖或糖原的表达相近。综上所述，DN大鼠模型造模成功，模型+二甲双胍+中药组、模型+二甲双胍+卡托普利组均能改善肾组织病理变化，且二者差异无统计学意义。见图1。

2.3 大鼠肾小球超微结构透射电镜观察结果 电镜结果显示，正常组大鼠肾组织中肾小球毛细血管基底膜厚度平均为138.8 nm，足细胞排列整齐。模型组大鼠肾小球基底膜均匀增厚，其最大值达354.26 nm，平均值为284.43 nm，约为正常组基底膜平均值的2倍。模型组肾足细胞发生融合，无电子致密物质沉积。与模型组比较，各给药组（DN+Met+ZY、DN+Met+Cap）大鼠的肾小球基底膜厚度均匀降低，足细胞融合度明显减少。见表3，图2～3。

2.4 转录组测序实验及生信分析结果

2.4.1 表达差异分析 模型组与正常组比较，转录本中共计13 345基因，其中可以找到6 626个显著上调基因，6 719个显著下调基因;模型+二甲双胍+中药组对比模型组，转录本中共计13 316个基因，其中可以找到6 480个显著上调基因，6 836个显著下调基因。见图4～5。

2.4.2 差异表达最为明显的双向调控基因 筛选出同时满足模型组对比正常组下调而模型+二甲双胍+中药组对比模型组上调的差异表达最为明显的双向调控基因共计6个，同时满足模型组对比正常组上调而模型+二甲双胍+中药组对比模型组下调的差异表达最为明显的双向调控基因共计4个。见图6～7。

2.4.3 差异表达基因GO富集分析结果 模型组对比正常组差异表达基因主要注释到生物学过程类别，包括细胞过程、单生物体过程、生物调节、代谢途径、刺激应答、多细胞生物体过程等;细胞组分类别主要包括细胞、细胞组成、细胞器、细胞膜、膜组成、细胞器组成、胞外基质、胞外基质组成、大分子复合物等;分子功能主要包括结合、催化活性、转运体活性、分子功能调节子、分子转化活性、信号转化活性等。见图8。模型+二甲双胍+中药组对比模型组差异表达基因主要注释到生物学过程类别，包括单生物体过程、细胞过程、生物调节、刺激应答、代谢途径、多细胞生物体过程、定位等;细胞组分类别主要包括细胞、细胞组成、细胞器、细胞膜、膜组成、胞外基质、胞外基质组成、细胞器组成、大分子复合物等;分子功能主要包括结合、催化活性、转运体活性、分子功能调节子、信号转化活性、分子转化活性等。见图9。

2.4.4 差异表达基因KEGG通路富集分析结果   模型组对比正常组差异表达基因显著富集的前20条信号通路有丙肝、甲流、色氨酸代谢、RIG-1样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、cAMP信号通路、Toll样受体信号通路等。见图10。模型+二甲双胍+中药组对比模型组差异表达基因显著富集的前20条信号通路有代谢相关通路（超过20个基因）、cAMP信号通路、PPAR信号通路、TGF-β信号通路、cGMP-PKG信号通路等。见图11。

3 讨论

本观察组前期研究发现活血降糖饮不仅能有效地改善胰岛素抵抗，增加胰岛素敏感性，调节糖脂代谢紊乱，减少蛋白尿，延缓肾功能下降[7-9]。而本次基础研究也表明其不仅能降低血糖、血脂，亦能减少尿蛋白及尿微量白蛋白排泄量;此外，HE染色、Masson染色、PAS染色均提示模型组中肾组织发生了明显的病理变化，而给药组能有效改善，电镜结果提示DN大鼠肾小球毛细血管基底膜均匀增厚，肾足细胞发生融合，而给药组能改善肾小球GBM和系膜细胞功能，进一步说明了活血降糖饮能通过改善肾组织结构功能、减轻足细胞损伤、减少肾组织纤维化程度以及糖原或多糖含量，从而延缓DN进展，与前期研究结果一致。

同时，本实验还选取了正常组、模型组、模型+双胍+中药组的大鼠肾皮质组织进行转录组测序研究，进一步探寻活血降糖饮治疗DN的关键作用靶点。结果表明，模型组对比正常组与模型+二甲双胍+中药组对比模型组转录本中基因总量接近，模型组对比正常组上调或下调基因量与模型+二甲双胍+中药组对比模型组下调或上调基因量接近，其中筛选出差异最明显的反向调控基因10个。根据GO富集分析，模型组对比正常组与模型+二甲双胍+中药组对比模型组差异表达基因均主要注释到生物学过程类别，包括细胞过程、单生物体过程、生物调节、代谢途径等。KEGG前20条显著富集通路分析显示模型组对比正常组与模型+二甲双胍+中药组对比模型组共同作用的信号通路有代谢相关通路及cAMP信号通路。

Cftr即囊性纤维化跨膜电导调节因子，是一种环磷酸腺苷（cAMP）依赖的跨膜氯离子通道蛋白，存在于多种组织、器官如呼吸道、消化道、生殖道、汗腺等的上皮細胞顶侧膜，在上皮液体分泌过程中具有重要作用。有研究发现Cftr在糖尿病胰岛B细胞中低表达是β细胞胰岛素分泌减少和功能受损的一个重要因素[12]，其参与调控β细胞分泌功能，并通过此功能参与调节胰岛损伤。Cftr激活途径有2条：cAMP依赖的PKA途径及效应剂直接与蛋白质作用从而改变CFTR的构象。当cAMP浓度升高时，CFTR蛋白构型改变、通道开放、氯离子外流。阴离子的主动运输促使阳离子分泌，进而导致水沿着渗透梯度排放，在维持人体电解质的平衡和内稳态方面发挥重要作用。前期研究发现活血降糖饮能增加糖、脂毒性导致的受损胰岛素细胞内cAMP含量，cAMP浓度增加并激活蛋白激酶A（Protein Kinase A，PKA），通过cAMP/PKA激酶通路增强β细胞内胰岛素基因的转录和翻译，并提高对葡萄糖刺激信号的敏感性，从而增加胰岛素分泌量[13]。本研究结果显示CFTR跨膜离子通道在模型组对比正常组表达明显降低，而在模型+二甲双胍+中药组对比模型组表达明显升高，表明活血降糖饮治疗DN可能是通过作用于cAMP/PKA通路上调Cftr从而改善胰岛细胞功能降低血糖实现的。

丙酮酸脫氢酶复合物（PDC）可以催化线粒体中丙酮酸转化为乙酰辅酶A，是葡萄糖氧化的关键调节酶。丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）磷酸化PDC从而抑制其活性。Pdk4即丙酮酸脱氢酶激酶4，是PDK同工酶中的一种，在骨骼肌、肝脏、肾脏等具有高度的脂肪酸氧化能力，是PDC调节物质代谢的中心，是丙酮酸氧化和葡萄糖维持体内平衡的关键酶[14-15]。研究发现，PDK4表达上调可使葡萄糖向脂肪酸转换，诱导胰岛素抵抗，加速血糖升高和糖尿病病情的进展[16]，而抑制Pdk4表达可提高PDC活性，从而促进葡萄糖氧化，抑制无氧糖酵解和脂肪酸氧[17]，改善胰岛素抵抗[18]。本研究发现，模型组对比正常组中Pdk4明显上调，而在模型+二甲双胍+中药组对比模型组明显下调，提示Pdk4高表达降低了葡萄糖氧化水平，减少了组织对葡萄糖的摄取从而升高了血糖，而活血降糖饮可显著下调Pdk4，可能与其能提高PDC活性，调节葡萄糖代谢及改善胰岛素抵抗有关。

Angptl4即血管生成素样蛋白4，是一种参与糖和脂质代谢的分泌型蛋白，与糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗有密切关系[19]。其作用主要体现在氧化代谢、血管发生创伤、修复及肿瘤转移等方面。有研究发现，Angptl4可以损伤足细胞，致使机体发生肾小球病变进而产生大量蛋白尿，而在足细胞相关肾病中，也发现肾小球足细胞分泌的Angptl4表达增加[20-21]。本研究也发现模型组肾小球毛细血管基底膜均匀增厚，肾足细胞发生融合，模型组对比正常组Angptl4明显上调，而经活血降糖饮治疗后肾小球基底膜厚度均匀降低，足细胞融合度明显减少，且模型+二甲双胍+中药组对比模型组Angptl4明显下调，证明活血降糖饮可能是通过抑制Angptl4的表达，从而改善足细胞的损伤，减少蛋白尿，以缓解糖尿病的进展。

Hmgcs2即3羟3甲基戊二酰辅酶A合酶2，是合成酮体的限速酶，其代谢产物酮体会诱导肾小管上皮细胞的转分化及炎症介质表达增加。有研究证实，肾小管损伤是DN的早期特征，肾小管病变可通过管球反射引起高滤过，从而导致肾小球的病变[22-23]。杨慧[23]研究发现，不论是糖尿病实验鼠还是糖尿病患者的肾脏组织，Hmgcs2主要在表达在肾小管中。高血糖会诱导肾小管上皮细胞Hmgcs2表达增加，从而导致酮体合成增加，而酮体主要在近端肾小管被重吸收，会直接诱导肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化及炎症介质表达增加，从而加重肾小管的损伤，导致糖尿病的发生发展;此外，酮体还会刺激氧自由基的产生并导致脂质过氧化，而此会导致糖尿病血管疾病的发生[24-27]。在本研究中，模型组对比正常组Hmgcs2明显上调，提示Hmgcs2是DN的潜在靶向基因，与目前关于Hmgcs2介导DN发生发展的研究结果相呼应;而模型+二甲双胍+中药组对比模型组Hmgcs2明显下调，提示活血降糖饮可能通过下调DN肾小管中Hmgcs2的表达，减少酮体的生成从而保护肾脏以延缓DN进展。

其他差异表达较为明显的反向调控基因LOC361914、Slc7a12、Gpa33、Prss35、Atp1a4、Atp12a在目前尚未发现与糖尿病及DN相关的作用机制研究，后期可立足于这些靶向基因进行进一步分子机制研究，为DN的防治提供有效途径和新的药物。

综上所述，活血降糖饮联合二甲双胍能降低血糖、血脂，减少尿蛋白及尿微量白蛋白排泄量，改善肾功能，同时还能改善DN的肾脏病理改变。中医学治疗疾病常以多靶点、多途径进行全面调节以及个体化治疗方案为特点。本研究表明活血降糖饮治疗DN可能是通过多靶点，多途径实现的。其对DN的防治作用主要体现在改善胰岛细胞功能、调节葡萄糖代谢、减轻肾小球足细胞损伤及肾小管损伤，而这些双向调控的靶向基因是通过哪些通路以及具体分子机制还需进一步研究。

参考文献

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（2019-09-03收稿 责任编辑：王明）