HPLC法测不同中药中蛇床子素的含量

赵新红，张作华，范 珊，侯雪芹，齐永秀，李 珂

（山东第一医科大学 药学院，山东 泰安 271000）

蛇床子、独活等中药材均含有蛇床子素的成分[1-2]，蛇床子素是香豆素类成分中最主要药效成分，具有镇静、抗炎、免疫调节，保护神经，抗骨质疏松，保护心血管，保护肾脏的功效，在现代药理学中的作用尤为显著[3]。

1 仪器与材料

Waters e2695 高效液相色谱仪（美国 Waters 公司），KQ-500E 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FR224CN 型电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司），凯特离心机（盐城凯特实验仪器有限公司），GM 0.33A 隔膜真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）

甲醇（美国天地高纯溶剂有限公司），水（杭州娃哈哈集团有限公司），蛇床子素对照品（批号 17080510，含量质量分数 99.81%）。

蛇床子[Cnidium monnieri（L.）Cuss]、独活（Angelica pubescensMaxim.f.biserrataShan et Yuan）、白芷[Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.ex Franch.et Sav]等药店购买，产地四川，菟丝子（Cuscuta chinensisLam.）、白前[Cynanchum stauntonii（Decne.）Schltr.ex Levl]等药店购买，产地安徽。以上中药均由山东第一医科大学中药学教研室曲晓兰副教授鉴定均符合《中华人民共和国药典》2020 年版（一部）项下有关规定。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备

将适量蛇床子药材于研钵内研磨成粉末，称取 5 g 置于 50 mL 棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，超声处理 30 min，室温冷却，甲醇补足至刻度，静置片刻，于 3 000 r·min-1离心 5 min，将上清液经 0.45 μm 微孔滤膜滤过，滤去初滤液 2.0～3.0 mL，取续滤液即得，备用。

2.1.2 对照品溶液的制备

取蛇床子素对照品适量，加甲醇定容至 25 mL 棕色量瓶中，摇匀，制得质量浓度为 2.016 g·L-1的蛇床子素储备液。

2.2 色谱条件

色谱柱为 Aglient C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-体积分数 0.05% 磷酸（体积比 70:30）。检测波长为 322 nm，流速为 1.0 mL·min-1，进样量为 10 μL，柱温为 30 ℃[4]。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验

分别将甲醇（溶剂）、蛇床子素对照品溶液、蛇床子供试品溶液，按照“2.2”条色谱条件进样，测得色谱图。由图1 可知，蛇床子素的保留时间为 11.9 min。供试品溶液主峰的保留时间与蛇床子素对照品的色谱峰保留时间一致。以蛇床子素色谱峰计算理论塔板数为 1 600，与相邻组分分离较好。

Fig.1 HPLC of blank solvent (A), reference solution (B) and test solution (C)图1 空白溶剂（A）、对照品溶液（B）和供试品溶液（C）的高效液相色谱图

2.3.2 线性与范围

分别精密量取蛇床子素对照品储备液 0.496、2.73、4.96、7.19和9.43 mL 置 10 mL 量瓶内，并用甲醇定容至刻度，摇晃均匀，即可得到质量浓度为 0.100、0.550、1.00、1.45 和 1.90 g·L-1的蛇床子素对照品溶液，按“2.2”条色谱条件各质量浓度对照品溶液分别进样 3 次，取平均值，以峰面积（A）为纵坐标，质量浓度为横坐标（ρ，g·L-1）绘制标准曲线图。所得回归方程为：A=3.0 × 107ρ- 3.0 × 105，r= 0.999 2。结果表明，蛇床子素在质量浓度为 0.100～1.90 g·L-1内与峰面积线性关系良好。

2.3.3 精密度试验

取“2.1.1”项下供试品溶液，按“2.2”条色谱条件，进样量为 10 μL，重复进样 6 次，记录色谱图，记录蛇床子素的峰面积。计算蛇床子素的 RSD 为 0.36%，小于 3.0%，表明该方法的精密度良好。

2.3.4 稳定性试验

按“2.1.1”项下方法新配制蛇床子供试品溶液，室温下放置，分别在 0、2、4、6、8、10、12 h等不同时间点分别进样，记录蛇床子素的峰面积。计算蛇床子素 RSD 为 0.45%，小于 3.0%，结果表明本蛇床子供试品溶液在 12 h 内保持稳定，稳定性良好。

2.3.5 重复性试验

取蛇床子粉末 6 份，分别按“2.1.1”项下实验方法配制溶液，按“2.2”项下色谱条件进行进样分析，记录蛇床子素的峰面积。计算蛇床子素的 RSD 为 0.28%，小于 3.0%，重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验

按“2.1.1”项下方法配制蛇床子溶液 3 份，分别按 80%、100%、120% 高中低 3 个不同质量浓度精密量取对照品储备液加入其中，甲醇定容至刻度，摇晃均匀，精密量取 1 mL 于进样瓶进样，进样量 10 μL，每种质量浓度进样 3 次。每份按照“2.2”项下色谱条件进行测定。分别记录其色谱图峰面积。结果见表1。

Table 1 Recovery test results of osthol in samples表1 样品中蛇床子素加样回收试验结果

2.3.7 样品含量测定

取菟丝子、独活、白芷、白前等中药药材，分别将其置于研钵内研成细粉，按“2.1.1”项下方法制备供试溶液，分别按“2.2”项下色谱条件取 3 份进行测定[5]，结果见表2。

Table 2 Determination results of osthol in different Chinese medicinal materials（mg·g-1）表2 不同中药材中蛇床子素含量测定结果（mg·g-1）

3 讨论

通过在实验过程中对高效液相色谱条件的不断优化，使蛇床子素的出峰时间和分离效果较好，本实验首先通过对蛇床子素标准品溶液进样，进行梯度洗脱以确定试验中流动相的大体比例，后采用等度洗脱对流动相的比例进行调整，进一步选择最适合于该试验的流动相比例，来达到优化的目的，使实验的结果更加的可靠。

实验中以甲醇作为有机相，调试水相来使色谱峰分的更好，分别尝试不同体积分数的甲酸、冰醋酸、磷酸等不同流动相作为该实验的水相[6-7]，进样蛇床子素标准品溶液得到标准品的色谱图，从色谱图比较来看，当水相为 0.05% 磷酸水溶液的时候，色谱图中蛇床子素的所出的峰更加稳定分离效果更好，与其他峰的干扰小。

关于蛇床子、独活等中药中蛇床子素的提取：《中华人民共和国药典》2015 版（一部）均是采用无水乙醇溶解、超声处理[8]，其提取方法简便、快速，但无水乙醇极易挥发，导致所配制的溶液浓度极不稳定，导致耗时、耗材。有文献采用薄层色谱法测蛇床子素的含量[9]，手动操作比较多，人为的影响因素大，重现性不好。本实验在查阅以及研究文献的基础上，采用甲醇溶解、超声，提取方法同于《中华人民共和国药典》2015 年版，提取效果相似，配制的溶液较为稳定。通过 e2695 高效液相色谱仪自动进样测定、消除人为因素，且方法简便快捷，重现性较好。