贮藏方式和贮藏时间对苜蓿干草霉菌数量和种类的影响

孙雷雷，赵桂琴*，柴继宽，刘富渊, 聂秀美，王 军

(1.甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070；2.甘肃大业草产品研究所有限责任公司，甘肃 酒泉 735000)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是全球最重要的多年生豆科牧草之一，具有较高的营养价值和经济价值，其主要利用方式为初花期收获调制干草[1-2]。苜蓿在其收获时往往会携带大量真菌，这些真菌在晾晒和打捆过程中如果没有得到有效控制，就会在贮藏期间生长繁殖，霉菌的种类也会因贮藏过程中微环境的变化而发生改变，由田间真菌过渡到储藏真菌，致使干草发霉变质。储藏真菌多为曲霉属和青霉属的产毒真菌，会对草食家畜产生毒害[3-6]。因此，研究苜蓿干草贮藏过程中真菌种类和数量的变化对苜蓿干草的安全贮藏具有重要意义。

大多数苜蓿干草都贮藏在储草棚内，但仍有部分干草由于储草棚不足或没有储草棚而在露天贮藏，尤其是在冬春季干旱少雨的西北苜蓿产区，这种现象较为普遍。露天贮藏时，有的会在草垛顶部加一层苫布，有的没有任何防护措施，干草受外界温湿度影响较大[7]，给真菌的生长繁殖创造了良好的环境。

国内外对各种粮食作物的真菌区系作了很多研究[8-11]，但苜蓿干草贮藏过程中的真菌方面的研究较少[12]。高彩霞[13]研究表明，打捆后第10天，苜蓿干草的优势真菌有镰刀菌属、青霉属、曲霉属、链格孢霉属、茎点霉属和木霉属共6个菌属；荣磊[14]研究发现，未添加防霉剂的高水分苜蓿草捆贮藏过程中主要优势菌属为链格孢属、木霉属、曲霉属和镰刀菌属，次优势菌属为明枝霉属、茎点霉属、变胞属和离孺孢属。上述试验都是针对高水分苜蓿干草捆的霉菌进行了鉴定，但只鉴定到属。刘香萍[15]发现高水分苜蓿干草中有青霉属8种，曲霉属5种，镰刀菌属3种。这项研究是在打捆后30天取样进行的，后续贮藏过程中霉菌种类会发生怎样的变化还不清楚。而实际生产中苜蓿干草捆通常要贮藏3～6个月甚至一年左右，在此期间霉菌数量和种类会随着贮藏时间和条件的变化而发生变化，因此有必要对整个贮藏期间的霉菌变化动态进行检测，以了解和掌握其基本规律。

传统的真菌鉴定方法主要有PDA平皿培养法和形态鉴定法。PDA平皿培养法既可以用于真菌的数量监测(需添加氯霉素抑制细菌的生长)，也可用于对纯化真菌的菌落和镜检形态的鉴定[16]。形态鉴定法是观察纯化的真菌菌落的颜色、纹路、生长速度等特征，并挑取菌丝在光学显微镜下观察菌丝结构以及分生孢子的特征。将其与真菌检索表中的真菌特征逐一比较，如果吻合，就可以认为是同种[17-18]。然而真菌在形态、生理生化等方面的复杂性及其随着环境变化而变化的特性，使得这些传统的形态学鉴定具有一定的局限性[3]。

随着分子生物学的发展，扩增真菌的rDNA-ITS片段进行真菌菌株种属的鉴定及系统发育研究，已经变得越来越广泛[19]。国内有学者以形态学观察结合ITS基因序列的方法分别从储藏稻谷中鉴定出一株菌核曲霉(A.sclerotiorum)和一株扩展青霉(Penicilliumoxalicum)[20-21]；何瑞芳等[22]利用形态鉴定法结合分子鉴定将进境的美国苜蓿干草中携带的真菌鉴定到37属52种；王慧[23]也通过此法将苜蓿黄斑病的病原菌鉴定为苜蓿枝梗边裂壳SporonemaphacidioidesDesmaz.(无性阶段)和苜蓿小光壳Leptotrochilamedicaginis(Fckl.)H.Schiiepp(有性阶段)。由此可见，利用形态鉴定法结合分子鉴定，可达到快速准确的鉴定目的。

甘肃河西地区作为全国苜蓿商品草的主要产区，苜蓿干草在贮藏过程中霉菌是否会因贮藏条件和贮藏时间而发生变化，目前尚未见研究报道。因此本研究拟采用PDA平皿培养法、形态鉴定法结合rDNA-ITS序列分析法，对来自甘肃苜蓿主产区酒泉市肃州区不同贮藏方式和时间下的苜蓿干草捆进行霉菌数量和种类变化方面的研究，旨在为河西地区苜蓿干草生产和贮藏提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于酒泉市肃州区甘肃大业草产品研究所有限责任公司的场院内，地理位置为东经98°29′、北纬39°41′，海拔1 360 m，年平均降水量87.7 mm，年平均日照时数3 033.4 h，年平均气温7.3℃，7月份最高平均气温21.8℃，1月份最低平均气温—9.7℃。

1.2 试验设计

采用甘肃大业草产品研究所有限责任公司2018年在上坝基地收获的第一茬紫花苜蓿。经自然晾晒至含水量为15%后打成小方捆，草捆长为1.05 m，宽为0.45 m，高为0.35 m，打捆密度为150 kg·m-3。分露天贮藏、苫布贮藏和储草棚贮藏3种贮藏方式。在干燥的水泥地面码垛，堆成尖顶方形垛，或露天放置(露天贮藏)，或在顶部加上苫布(苫布贮藏)，或直接在就近的储草棚内码垛(储草棚贮藏)。贮藏期从2018年6月3日到2019年5月28日，分别在贮藏的第0 d，30 d，60 d，90 d，150 d，210 d，270 d，360 d，用电动取样器在草垛的4个面分上、中、下3层取样，每层取4个样混合均匀，然后装入带有冰袋的保温盒中，带回实验室后立刻放入-20℃超低温冰箱中，尽快测定霉菌数量。

1.3 测定内容与方法

1.3.1草样菌悬液制备 称干草样10 g于盛100 mL无菌水的三角瓶中，上旋转式摇床(200 r·min-1)充分振荡(10 min)，取菌悬液1 mL放入9 mL无菌水的试管中，配成10-1的菌悬液，再从10-1浓度的菌悬液试管中吸1 mL加入另一支9 mL无菌水的试管中，配成10-2浓度的菌悬液。以此类推，配成10-3浓度的菌悬液。

1.3.2霉菌数量检测 采用平板计数法测定。取10-2，10-3两个浓度的稀释液各0.4 mL在事先倒好的虎红琼脂培养基上，用涂布棒将菌液在培养基上涂抹均匀，每个稀释度重复3次，同时作空白对照，于28℃恒温培养箱中培养，72 h后待长出米粒大小白色菌落时进行计数。

计算公式为：N=au/v。

式中：N为1 g干草样的菌数；a为培养皿中平均菌落数；u为稀释倍数；v为每个培养皿中加菌悬液的体积(mL)。

1.3.3霉菌的分离和纯化 将上述菌落再培养2 d，待菌落长出颜色，能区分开不同菌落时挑取菌丝至新鲜PDA培养基上分离、纯化菌落，纯化后的菌株于-20℃保存备用。

1.3.4霉菌的形态学观察 参照《真菌鉴定手册》[24]和《真菌分类学》[25]，把分离纯化得到的真菌接种在PDA培养基上，25℃下培养7 d，观察菌落的颜色、纹路、生长速度等特征，并挑取分生孢子用无菌水制作水装片，观察孢子的形态特征，进行真菌的初步鉴定。

1.3.5霉菌的分子生物学鉴定 将分离纯化的霉菌在PDA培养基培养7 d左右后，采用真菌基因组Omega试剂盒提取各干草霉菌DNA，并利用真菌ITS通用引物对ITS1和ITS4进行扩增，反应体系为50 μL：2×Taq PCR Master Mix溶液25 μL，10 μmol·L-1上下游引物各2 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 16 μL。反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，34个循环；72℃终延伸7 min。将PCR产物经电泳检测后送样进行测序，测序结果与GenBank库中的核酸序列进行同源性比对，并通过Mega 7.0软件以邻接法(Neighbor joining，NJ)进行菌株的亲缘关系分析。

1.4 数据处理

利用Excel 2007，SPSS 19.0专业版数据分析软件进行数据处理、方差分析及相关分析，用BLAST软件将上传序列与NCBI同源序列对比分析，下载与其相似度较高的菌株序列作为参考，采用Mega 7.0软件邻接法(Neighbor Joining，NJ)构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 苜蓿干草贮藏过程中霉菌数量的动态变化

随着贮藏时间的延长，苜蓿干草的霉菌数量总体呈先上升后逐渐下降再明显上升的趋势(图1)。在贮藏过程中，环境温度呈先上升后下降再上升的趋势，湿度变化与温度类似。贮藏6个月时温度达到最低(参照贮藏期间肃州区的气象数据)。贮藏0 d时，3种贮藏方式下的霉菌数量无明显差异。贮藏30 d时，露天贮藏的霉菌数量急剧上升，增加了2倍左右；苫布贮藏的也显著增加，较一个月前增加了132.54%；储草棚内的苜蓿干草霉菌数量也有所增加(33.25%)。随后各处理的霉菌数量逐渐开始下降，到贮藏210 d时降至最低。这时露天贮藏的苜蓿干草霉菌数量仍然最高(7.41×103个·g-1，P<0.05)，苫布贮藏的次之，储草棚内的霉菌数量仍然最低(3.31×103个·g-1)。随后苜蓿干草的霉菌数量又有所上升，到270 d时，露天贮藏、苫布贮藏和储草棚贮藏3个处理的霉菌数量均较210 d有所增加，增幅分别为10.13%，2.22%和51.85%。当贮藏时间延长至360 d，苜蓿干草的霉菌数量达到一年中的最大值，分别为：露天贮藏1.74×104个·g-1，苫布贮藏1.18×104个·g-1，储草棚贮藏7.29×103个·g-1；3个处理间的差距进一步拉大，露天贮藏的苜蓿干草霉菌数量是储草棚贮藏的2.39倍。另外，由图1可知，在一年的贮藏过程中，储草棚内的苜蓿干草霉菌数量变化幅度最小，波动曲线较为平缓(3.31×103～7.29×103个·g-1)；露天贮藏的变幅最大(4.57×103～1.74×104个·g-1)，而且其霉菌数量一直显著高于其他两个处理。

图1 不同贮藏方式下苜蓿干草霉菌数量变化情况

2.2 苜蓿干草中真菌形态学观察

分离纯化的真菌在PDA培养基培养7 d后，观察和描述菌落形态和分生孢子形态特征。部分菌落和孢子形态如图2。

球孢白僵菌(Beauveriabassiana，图2 A-C)在PDA培养基上生长较慢，直径约23 mm。菌落前期绒毛状，后期粉末状，中间凸起厚粉末，正面白色，背面橘黄色。分生孢子球形，直径为1.5～2.5 μm，孢子聚集时呈球形的孢子簇。

枝状枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides，图2 D-F)在PDA培养基上生长缓慢，直径约21 mm。菌落稍微隆起，中央有裂纹，呈粉状，边缘呈白色，正面橄榄绿色，背面橄榄褐色。分生孢子单生或串生，呈近球形或卵形，大小为(2.8～7.6)μm×(2.0～3.5)μm。

细交链孢(Alternariaalternate，图2 G-I)在PDA培养基上生长快，直径约81 mm。菌落中央隆起，呈粗绒状，正面棕褐色，背面灰褐色。分生孢子单生，呈倒梨形、倒棒状，淡黄褐色，具横隔1～4个，纵隔0～2个，部分含有短喙，大小为(8.1～17.2)μm×(2.4～6.5)μm。

赭曲霉(Aspergillusochraceus，图2 J-L)在PDA培养基上生长较快，菌落直径达68 mm，菌丝体白色，菌落淡黄色，菌落丝绒状，有同心轮纹，无渗出液，菌落反面淡黄褐色。分生孢子梗粗糙有麻点，分生孢子单生，呈球形，直径2.0～3.2 μm。

苜蓿茎点霉(Phomamedicaginis，图2 M-O)在PDA培养基上生长较快，直径约43 mm。菌落呈毡状，中央略凸起，正面褐色，边缘具白色絮状，背面黑褐色。菌丝透明，有分隔，分生孢子单生或串生，大小6.0～11.7 μm×2.5～4.8 μm，常变为双胞。

变黑轮枝菌(Gibellulopsisnigrescens，图2 P-R)在PDA培养基上初期菌落为白色，气生菌丝不发达，培养后期菌落表面产生浅白色粉尘，其上具有黑褐色大小不等的斑块。分生孢子梗多为二次分枝，分生孢子椭圆形透明，单胞；可产生球形的黑色厚垣孢子，直径为4.4～5.6 μm。

三隔镰刀菌(Fusariumtricinctum，图2 S-U)在PDA培养基上生长较快，直径约65 mm，菌丝为白色，子座呈玫瑰红色，培养基背面呈现白红相间的同心圆；大型分生孢子呈镰刀形，多3个隔膜，大小为29 μm×2.9 μm，少数为4～5个隔膜，大小为36 μm×3.5 μm。

图2 菌落和分生孢子的形态特征

2.3 苜蓿干草中真菌分子生物学鉴定

对PDA培养基分离出的所有表观形态特征略有差异的78株分离菌株进行分子生物学鉴定。基于ITS序列，采用邻接法将所有分离菌种构建系统发育树，对分离菌种的种属进一步确认。

由图3可知，河西地区贮藏的苜蓿干草共检出真菌16属41种。属水平分别为链格孢属(Alternariasp)、枝孢属(Cladosporiumsp)、镰刀菌属(Fusariumsp)、轮枝孢属(Gibellulopsissp)、毛霉属(Mucorsp)、茎点霉属(Phomasp)、根霉属(Rhizopussp)、篮状菌属(Talaromycessp)、白僵菌属(Beauveriasp)、漆斑菌属(Myrotheciumsp)、青霉属(Penicilliumsp)、曲霉属(Aspergillussp)、织球壳属(Plectosphaerellasp)、枝顶孢属(Acremoniumsp)、帚枝霉属(Sarocladiumsp)和Alfaria属；其中曲霉属真菌种类最多，为10种，镰刀菌属和青霉属次之，分别为5种和4种。

图3 苜蓿干草贮藏过程中真菌的系统发育树

2.4 不同贮藏方式下苜蓿干草真菌种类的变化

露天贮藏的苜蓿干草在为期一年的贮藏过程中共检出15属35种真菌(表1)，苫布贮藏的苜蓿干草在贮藏期内共检出13属33种真菌(表2)，储草棚贮藏的苜蓿干草共检出13属33种真菌(表3)。3种贮藏方式下，每个采样时间点均能检出的霉菌有细交链孢(Alternariaalternata)和枝状枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides)两种，8个时间点中检出5次以上的真菌有产黄青霉(Penicilliμmchrysogenum)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)。细极链格孢(Alternariatenuissima)和禾谷漆斑菌(Myrotheciumgramineum)只在贮藏的前期检出，150 d后再未检出。

表1 苜蓿干草露天贮藏过程中真菌种类的变化

表2 苜蓿干草苫布贮藏过程中真菌的种类变化

甜菜茎点霉(phomabetae)、疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)、冻土毛霉(Mucorhiemalis)、易脆毛霉(Mucorfragilis)、赤曲霉(Aspergillusruber)和紧密帚枝霉(Sarocladiumstrictum)仅在露天贮藏的苜蓿干草中检出。雪曲霉(Aspergillusniveoglaucus)仅在苫布贮藏的处理中检出。斯氏青霉(Penicilliμmsteckii)、Acremoniumfusidioides和交互枝顶孢(Acremoniumalternatum)仅在储草棚内的苜蓿干草中检出。杂色曲霉(Aspergillusversicolor)在露天未检出，在储草棚和苫布贮藏条件下各检出一次。露湿漆斑菌(Myrotheciumroridum)在苫布贮藏中未检出，在露天和储草棚贮藏的干草中各检出1次。Alfariaterrestris在储草棚贮藏中未检出，在露天和苫布贮藏中各检出一次。

由表1、表2和表3可知，苜蓿干草的带菌种类数都随贮藏时间的延长呈先增加后降低再增加的趋势，但不同贮藏方式下具体的变化各有特点。露天贮藏方式下，苜蓿干草的霉菌种类在贮藏60 d时即达到峰值(22种)，90 d时为21种，随后下降至17种，到360 d时增至19种。苫布贮藏方式下，苜蓿干草的霉菌种类在贮藏90 d时达到最高(20种)，随后急剧下降至13种，随后在贮藏270 d时增至17种，直到贮藏360 d再未增加。储草棚内的苜蓿干草霉菌种类在贮藏30 d即达到较高值(16种)，但随后几乎没有变化(仅在60 d时减少1种)，直到储藏360 d时增加了1种，和其他两种贮藏方式相比波动最小。

表3 苜蓿干草在储草棚贮藏过程中真菌的种类变化

3 讨论

3.1 贮藏方式和贮藏时间对苜蓿干草霉菌数量的影响

贮藏方式和贮藏时间对苜蓿干草的霉菌数量有显著影响。随着贮藏时间的延长，苜蓿干草的霉菌数量总体呈增加的趋势。这是因为在贮藏初期，苜蓿干草携带的真菌多为田间真菌，且数量不多，随着贮藏时间的延长，真菌开始快速繁殖，达到一个小高峰；之后由于环境的恶化(冬季低温)，真菌的数量又开始降低；随着春季冰雪消融，气温上升，贮藏环境适宜真菌的生长繁殖，因此真菌数量又快速上升。史莹华等[26]也发现，贮藏时间越长，苜蓿干草捆中霉菌数量越多。含水量较高(20%)的苜蓿干草贮藏半个月后霉菌数量最高可达9.17×104个·g-1[27]。苜蓿草颗粒中如果不添加防霉剂，7天后霉菌数量可达9.60×104个·g-1[28]。露天贮藏方式下的干草真菌数量较同期苫布和储草棚贮藏的真菌数量显著增多，储草棚内的苜蓿干草霉菌数量变幅最小。露天贮藏受外界环境的影响最大，因此在一年的贮藏期内霉菌数量变化剧烈。李改英等[29]在进行不同淋雨模式对苜蓿霉菌生长规律影响的研究时发现，未淋雨的对照组苜蓿草霉菌数量变化不大，而间隔淋雨的苜蓿草(相当于露天贮藏)在第3天霉菌就开始大量生长。

3.2 贮藏方式和贮藏时间对苜蓿干草霉菌种类的影响

在真菌种类的鉴定方面，目前通常采用的是形态学和分子生物学技术相结合的方法[19]。将分离纯化的菌株接种到PDA培养基上25℃黑暗培养3～5天，观察菌落形态、生长速度、颜色、大小等，结合菌丝的形态和分生孢子的有无及其特点进行初步鉴定[17-18]，然后用真菌的通用型引物ITS[30]进行扩增测序，精准鉴定。本研究用形态特征结合分子鉴定发现，在为期一年的贮藏期内，从苜蓿干草中共检测出16属41种真菌，其中曲霉属真菌10种，镰刀菌属5种、青霉属4种。在贮藏初期，3种贮藏方式下的苜蓿干草都检出了链格孢属、枝孢属、镰刀菌属的真菌，这些都属于田间真菌，对水活度要求相对较高。贮藏中后期，随着苜蓿干草含水量进一步降低，田间真菌的数量开始下降，而对水活度要求相对宽泛的过渡真菌开始增多。3种贮藏方式下的苜蓿干草中曲霉属、青霉属的真菌成为优势菌，检出率都较高，这些都属于储藏真菌，对水活度要求相对较低[6]。

苜蓿干草的带菌种类数都随贮藏时间的延长呈先增加后降低再增加的趋势。储草棚内的苜蓿干草带菌种类变化最小，露天贮藏的苜蓿干草带菌种类最多、波动最大，共检出15属35种，而苫布贮藏和草棚贮藏的都是13属。链格孢属的细交链孢和枝孢属的枝状枝孢菌在3种贮藏方式下的各贮藏时期都有检出，体现了其优势属的地位。曲霉属在整个贮藏过程中一共检出了10个种，也为优势属。另外，有6种真菌仅在露天贮藏的苜蓿干草中检出，而苫布贮藏和储草棚贮藏下只有1种和3种，进一步体现出露天贮藏的苜蓿干草不仅霉菌数量最多，独有的种类也最多。

检出的苜蓿茎点霉和链格孢属的真菌都属于常见的植物病原真菌，而匍枝根霉、黑曲霉、青霉属的几种真菌都属于常见的腐生性真菌。在贮藏前期，3种贮藏方式下的苜蓿干草中都检出了变黑轮枝菌，前人曾从发白矮化的苜蓿植株上分离得到这种菌，该菌可引起苜蓿出现叶片发白、节间缩短、植株矮化等症状[31]。贮藏中后期，在露天贮藏方式下检出了2种毛霉属真菌：冻土毛霉和易脆毛霉。这两种真菌在苫布和草棚贮藏下都未检出，可能是因为苫布和草棚降低了雨雪对苜蓿干草水分含量变化的影响。刘香萍[32]在对不同含水量的苜蓿干草进行真菌种类研究时发现，同一取样时期，高水分苜蓿草捆检测出了毛霉，而低水分苜蓿草捆未检出。在整个贮藏过程中，3种贮藏方式下都检出了白僵菌属的虫生真菌，且在露天贮藏的苜蓿干草中检出率更高，可能是露天贮藏的苜蓿干草给昆虫提供了庇护所。此外，本研究还检出了漆斑菌属的3种真菌和织球壳属的1种真菌，属首次报道，因为有研究认为其未在中国种植的苜蓿草上分布[22]。

4 结论

贮藏方式和贮藏时间对苜蓿干草的霉菌数量有显著影响。随着贮藏时间的延长，苜蓿干草的霉菌数量总体呈增加趋势，露天贮藏的霉菌数量最多，苫布贮藏的次之，储草棚内的苜蓿干草霉菌数量最低、变化最小。

贮藏方式和贮藏时间对苜蓿干草霉菌种类也有显著影响。随着贮藏时间的延长，苜蓿干草的霉菌种类呈先增后降再增的趋势，储草棚贮藏的苜蓿干草霉菌种类变化最小。共检出16属41种真菌，其中露天贮藏的苜蓿干草检出15属35种，苫布贮藏和储草棚贮藏均检出13属33种。优势属为链格孢属、枝孢属和曲霉属。

在甘肃河西地区，苜蓿干草宜采用储草棚贮藏，贮藏期不宜超过7个月。