基于miRNA测序技术探讨黄芪-丹参药对干预自发性高血压大鼠肾损害的机制研究

刘 瑶，李 伟

1.山东中医药大学中医学院，山东 济南 250355

2.山东中医药大学附属医院 肾内科，山东 济南 250014

高血压和肾脏病密切相关，互为病因和加重因素[1]。长期持续的原发性高血压，可引发肾小动脉肌内膜肥厚、管腔狭窄、细小动脉玻璃样变，继发肾实质缺血性损害，进一步加剧血压升高，二者形成恶性循环。高血压肾损害是终末期肾脏病（end stage renal disease，ESRD）的独立危险因素和主要病因。因此，探讨高血压肾损害的新型防治策略，有助于降低ESRD及其并发症的发生率。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类进化上非常保守、长度介于21～25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，通过其种子序列（5’端的2～8位核苷酸序列）与靶mRNA 3’非翻译端互补靶序列匹配，介导mRNA的降解或抑制蛋白质的翻译，进而调节相应基因表达。研究发现，miRNA不仅可以通过影响多种细胞活性和细胞增殖、凋亡、分化、迁移和死亡等生物学过程，从而在高血压发生发展中发挥重要作用[2-3]，也可作为糖尿病肾病、免疫性肾脏疾病、肾细胞癌等多种肾脏疾病的潜在治疗靶点[4-6]。

山东中医药大学附属医院李伟教授结合自身多年临床经验，主张气虚血瘀贯穿高血压肾损害始终，临床采用补气活血法治疗，可减少患者尿微量白蛋白的排泄，保护肾功能。黄芪-丹参作为补气活血的典型代表药对，在调控血压、舒张血管、抗凝、抗氧化、调节炎性反应等方面具有多重功效[7]。本课题组前期研究表明，黄芪-丹参药对能够降低自发性高血压大鼠的血压及双肾血流阻力指数（resistance index，RI），提高肾组织一氧化氮（nitric oxide，NO）水平及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性，延缓高血压肾损害的发展进程[8-9]。本研究旨在通过miRNA测序技术，从转录组学角度探索黄芪-丹参药对在自发性高血压大鼠肾组织中的直接作用靶点，探讨其改善高血压肾损害的作用机制，为中药防治高血压肾损害提供依据。

1 材料

1.1 动物

24周龄SPF级雄性自发性高血压大鼠18只，同周龄WKY大鼠9只，体质量280～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2016-0006。动物于温度22～24 ℃、湿度50%～70%条件下适应性饲养1周，自由进食饮水。动物实验经山东中医药大学伦理委员会批准（批准号SDUTCM20210305023）。

1.2 药品与试剂

2 g黄芪中药配方颗粒（批号18013991）相当于饮片5 g，1 g丹参中药配方颗粒（批号18005862）相当于饮片10 g，均由山东中医药大学附属医院提供；QIAseq miRNA Library Kit、miRNeasy Mini Kit购自德国Qiagen公司；MiPure Cell/Tissue miRNA Kit（批号7E242G8）购自南京诺维赞生物科技股份有限公司；Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit（批号638313）、TB GreenTMEx TaqTMⅡ Kit（批号RR820A）购自Takara生物技术有限公司。

1.3 仪器

MRBP-RMC大鼠多通道无创血压测量系统（美国IITC公司）；Eclipse E100正置光学显微镜（日本Nikon公司）；Qubit®3.0 Fluorometer（美国Life Technologies公司）；Nanodrop One分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Agilent 2100生物分析仪（美国Agilent公司）；Hiseq Xten测序仪（美国Illumina公司）；Light Cycler480 II qRT-PCR仪（德国Roche公司）。

2 方法

2.1 动物分组与给药

取WKY大鼠9只作为对照组，将自发性高血压大鼠随机分为模型组和黄芪-丹参药对（3.4 g/kg）组，每组9只。根据本课题组前期研究[10]，黄芪、丹参饮片用量分别为5.09、2.55 g/kg，分别将黄芪、丹参配方颗粒用量定为2.036、0.255 g/kg，药物以0.9%氯化钠溶液溶解。各给药组ig药物（10 mL/kg），对照组和模型组ig等体积0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续4周。

2.2 黄芪-丹参药对对自发性高血压大鼠血压的影响

每周采用无创尾动脉加压法测量血压，记录每只大鼠清醒状态下尾动脉的收缩压与舒张压，连续测量3次。

2.3 黄芪-丹参药对对自发性高血压大鼠肾组织病理变化的影响

给药结束后，大鼠ip 3%戊巴比妥钠（80 mg/kg）过量麻醉处死，取肾组织，于中性多聚甲醛中固定48 h，切片（厚4 μm）后石蜡包埋，进行苏木素-伊红（HE）染色，以中性树胶封片，于显微镜下观察并拍照。

2.4 各组大鼠肾组织差异表达miRNA分析

2.4.1 肾组织RNA的抽提与纯化 随机选取各组大鼠各3只，按照试剂盒说明书提取肾组织RNA，用生物分析仪进行质量检测，采用Qubit®3.0 Fluorometer和Nanodrop One分光光度计进行定量分析。

2.4.2 文库构建与高通量测序 使用QIAseq miRNA Library Kit构建双端测序文库。纯化产物合成cDNA文库，继而进行定量检测，以确认插入片段的大小。通过cBot生成簇，将文库稀释至10 pmol/L，在Illumina Hiseq Xten测序平台上测序。

2.4.3 基因表达的数据分析 将每个具有miRNA序列的样品读长与已有miRNA数据库和新miRNA的预测结果进行比较，计算miRNA表达水平，并通过CPM筛选miRNA。使用DESeq软件分析样品miRNA表达并筛选出P＜0.05、倍数变化（fold change，FC）＞1.5或＜0.67的差异表达miRNA。

2.5 qRT-PCR验证差异表达miRNA

选择5个差异表达miRNA（miRNA-142-5p、miRNA-3585-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-122-5p、miRNA-125b-1-3p）进行qRT-PCR验证。使用MiPure Cell/Tissue miRNA Kit提取各组大鼠肾组织miRNA，用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit逆转录纯化的miRNA，合成cDNA。根据TB GreenTMEx TaqTMⅡ Kit试剂盒说明书进行qRT-PCR分析。以U6为内参，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.6 差异表达miRNA靶基因的预测、差异表达miRNA与靶基因网络的构建

利用miRanda算法从miRNA-mRNA序列匹配情况及能量稳定性方面综合预测差异表达miRNA靶基因。运用Cytoscape软件构建差异表达miRNA与相应靶基因的网络图。

2.7 统计分析

采用SPSS 17.0软件分析数据，数据以±s表示，两组用独立样本的t检验比较。

3 结果

3.1 黄芪-丹参药对对自发性高血压大鼠血压的影响

如表2所示，与对照组比较，模型组大鼠收缩压和舒张压显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，给药后第2周，黄芪-丹参药对组大鼠收缩压显著降低（P＜0.05），给药后第3、4周，收缩压和舒张压均显著降低（P＜0.05、0.01）。

3.2 黄芪-丹参药对对自发性高血压大鼠肾组织病理变化的影响

如图1所示，对照组可见肾小球体积正常，系膜区未见明显增生，系膜基质正常，未见肾小球硬化，肾小管上皮细胞形态正常；模型组可见肾小球体积轻度增大，分叶明显，系膜区增生，系膜基质增多，伴明显的中性粒细胞及其他炎性细胞浸润，轻度肾小管萎缩；黄芪-丹参药对组可见肾小球体积轻度增大，分叶不明显，系膜区轻度增生，伴轻度中性粒细胞和其他炎性细胞浸润。

表2 黄芪-丹参药对对自发性高血压大鼠血压的影响 ( ±s,n = 9)Table 2 Effect of Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair on blood pressure of spontaneously hypertensive rats ( ±s,n = 9)

表2 黄芪-丹参药对对自发性高血压大鼠血压的影响 ( ±s,n = 9)Table 2 Effect of Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair on blood pressure of spontaneously hypertensive rats ( ±s,n = 9)

与同组给药前比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与对照组同时间比较：##P＜0.01；与模型组同时间比较：△P＜0.05 △△P＜0.01 (1 mm Hg＝133 Pa)*P < 0.05 **P < 0.01 vs same group before administration; ##P < 0.01 vs control group at the same time; △P < 0.05 △△P < 0.01 vs model group at the same time (1 mm Hg = 133 Pa)

组别 剂量/(g·kg-1) 血压类型 血压/mm Hg 给药前 给药后第1周 给药后第2周 给药后第3周 给药后第4周 对照 — 收缩压 132.89±11.42 132.17±10.76 131.25±10.12 130.69±9.96 129.45±8.76 舒张压 109.41±10.17 106.78±11.32 104.65±9.93 102.89±9.57 100.18±10.08 模型 — 收缩压 198.76±5.72## 196.89±5.98## 194.37±4.97## 192.63±4.68## 191.75±5.05## 舒张压 171.38±6.64## 169.12±5.43## 166.54±6.12## 164.19±5.36## 163.07±4.91## 药对 3.4 收缩压 199.24±4.46 190.63±3.98 183.92±4.09*△ 179.12±4.14**△△ 173.42±4.96**△△ 舒张压 170.57±5.48 165.88±7.12 161.77±6.34 158.48±5.96*△ 150.17±6.99**△△

图1 黄芪-丹参药对对自发性高血压大鼠肾组织病理变化的影响 (HE,×100)Fig.1 Effect of Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair on kidney pathological changes of spontaneously hypertensive rats (HE,× 100)

3.3 各组大鼠肾组织差异表达miRNA分析

如图2、3所示，与对照组比较，模型组筛选得到115个差异表达miRNA，其中68个miRNA上调、47个miRNA下调，最具显著性差异的miRNA为miR-219a-2-3p；与模型组比较，黄芪-丹参药对组筛选得到91个差异表达miRNA，其中67个miRNA上调、24个miRNA下调，最具显著性差异的miRNA为miR-874-5p。

如表3所示，miR-219a-5p、miR-3585-5p、miR-142-5p在模型组表达上调，而在黄芪-丹参药对组表达下调，推测这3个基因的表达可能与黄芪-丹参药对的调控作用相关，因此将其作为后续研究的筛选靶点。

3.4 差异表达miRNA的qRT-PCR验证

如图4所示，各组大鼠肾组织miRNA-142-5p、miRNA-3585-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-122-5p和miRNA-125b-1-3pmRNA相对表达量与miRNA测序结果趋势一致，提示miRNA测序结果真实可靠，可用于进一步的深层次数据分析。

3.5 差异表达miRNA的功能分析

miRNA不编码蛋白质，但可通过调控mRNA发挥作用，因此，本研究通过对miRNA靶基因的预测，使用基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析分别对靶基因进行富集，以探讨miRNA在细胞内的潜在调控作用。GO功能分析包括细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物过程（biological process，BP）3个部分[11]。

如图5所示，与对照组相比，模型组GO功能富集程度最高的分别为阴离子跨膜转运、突触前、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性。与模型组相比，黄芪-丹参药对组GO功能富集程度最高的分别为Ras蛋白信号转导、囊泡膜、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性。

KEGG分析结果如图6所示，与对照组相比，模型组差异表达miRNA靶基因主要富集在哺乳动物雷帕霉素靶点（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路、自噬、腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信号通路、FoxO信号通路、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路等途径。与模型组相比，黄芪-丹参药对组差异表达miRNA靶基因主要富集在MAPK信号通路、mTOR信号通路、自噬、AMPK信号通路、TGF-β信号通路、Ras信号通路等途径。

3.6 差异表达miRNA与靶基因网络的构建

构建各组间差异表达miRNA和其靶基因的局部网络图见图7，以确定2种类型基因间的功能性相互作用，为进一步阐明黄芪-丹参药对改善高血压肾损害的作用机制提供依据。

图2 模型组与对照组比较 (A)、黄芪-丹参药对组与模型组比较 (B) 肾组织差异表达miRNA的热图Fig.2 Heat map of differential expression miRNA of kidney tissue in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B)

图3 模型组与对照组比较 (A)、黄芪-丹参药对组与模型组比较 (B) 肾组织差异表达miRNA的火山图Fig.3 Volcano map of differential expression miRNA of kidney tissue in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B)

表3 各组大鼠肾组织差异表达miRNATable 3 Analysis of differentially expressed miRNA in kidney of rats in each group

图4 模型组与对照组比较 (A)、黄芪-丹参药对组与模型组比较 (B) 差异表达miRNA的qRT-PCR验证Fig.4 qRT-PCR verification of differentially expressed miRNA in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B)

图5 模型组与对照组比较 (A)、黄芪-丹参药对组与模型组比较 (B) 差异表达miRNA靶基因的GO功能富集分析 (前10)Fig.5 GO function enrichment analysis of differentially expressed miRNA target genes in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B) (top 10)

图6 模型组与对照组比较 (A)、黄芪-丹参药对组与模型组比较 (B) 差异表达miRNA靶基因的KEGG通路富集分析 (前30)Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed miRNA target genes in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B) (top 30)

图7 模型组与对照组比较 (A)、黄芪-丹参药对组与模型组比较 (B) 差异表达miRNA与靶基因的网络图Fig.7 Network diagram of differentially expressed miRNA and target genes in comparison between model group and control group (A),comparison between Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma herbal pair group and model group (B)

4 讨论

持续稳定的高血压可诱发肾脏血流动力学改变，直接造成肾脏的组织病理变化，使肾小动脉管壁增厚、管腔狭窄，引发肾小球硬化、肾小管萎缩及肾间质纤维化，进而影响肾功能，因此，血压控制的稳定在一定程度上影响患者进入ESRD的时间和速度，早期发现并诊断对高血压肾损害患者的治疗和预后起至关重要的作用。肾活检虽是诊断疾病的金标准，但不常作为观察高血压肾损害患者病情动态变化的直接方法，寻找非创性生物标志物是高血压肾损害等肾脏疾病的研究目标。

miRNA作为关键上游基因，在促进或抑制高血压肾损害的发生发展中发挥重要作用。本研究miRNA高通量测序结果显示，模型组与对照组的miRNA表达谱存在差异，在筛选出的115个差异表达miRNA中，68个表达上调、47个表达下调，其中与对照组比较，模型组miRNA-142-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-3585-5p表达在miRNA测序和qRT-PCR验证中均上调。miRNA-142-5p可通过靶向调控信号淋巴细胞活化分子相关蛋白（SLAM-associated protein，SAP）、CD84抑制T细胞过度活化，间接影响B细胞的抗体生成，其表达水平与狼疮性肾炎的活动性密切相关[12]。在氧化低密度脂蛋白的刺激下，高表达的miRNA-142还可促进高脂血症及动脉粥样硬化的发展进程[13]。miRNA-219-5p被证实可以靶向结合E-钙黏蛋白并下调其表达水平，诱导上皮间质转化（epithelial mesenchymal trasition，EMT），进而影响器官纤维化的发生[14]。目前尚缺乏关于miRNA-3585-5p的详尽报道。本研究发现，经黄芪-丹参药对干预后，模型组大鼠上述3个基因表达水平均显著下调，提示miRNA-142-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-3585-5p可能是黄芪-丹参药对延缓高血压肾损害进程的直接靶点。

利用GO的结构功能体系，把参与同样功能或通路的基因进行分类，对研究高血压肾损害的发生发展机制有重要意义。本研究GO功能富集分析发现，与高血压肾损害相关的GO条目集中在阴离子跨膜转运、L-氨基酸转运、细胞生长、缺氧应答、囊泡膜、细胞质囊泡膜、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、L-氨基酸跨膜转运蛋白活性、小三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）酶结合等方面，提示由于高血压引起机体内环境的紊乱，使细胞质、囊泡膜等成分变化，影响机体缺氧应答、离子转运、细胞内信号转导及电解质平衡，致使机体能量代谢异常。KEGG通路分析显示，模型组差异表达miRNA的靶基因主要富集于mTOR、MAPK、自噬、AMPK及TGF-β信号通路等。mTOR是一种进化上相对保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其信号通路的激活可调节肾脏细胞内的自噬水平、氧化应激及炎性反应，使肾脏细胞外基质（extracellular matrix，ECM）生成增加，促进肾脏纤维化[15]；此外，mTOR通路还参与氨基酸、葡萄糖及脂质的代谢。MAPK通路是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号转导系统，在慢性肾衰竭模型大鼠中，MAPK信号通路被激活，p38 MAPK、胞外信号调控激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）、c-Jun-N-末端激酶（c-Jun-N-terminal kinase，JNK）蛋白的磷酸化水平升高，促进肾小管上皮EMT，加重肾纤维化的程度[16]。AMPK通路是细胞内能量的开关，高血压状态下局部肾组织的缺血缺氧可使AMPK通路激活，进而调控细胞内的能量、糖、脂及蛋白质代谢；AMPK通路可抑制mTOR通路，增强细胞自噬，参与高血压肾损害病理进程的调控[10]。TGF-β是公认的促肾纤维化细胞因子，可直接增强肾小管上皮EMT，引起ECM异常堆积，使肾小球基底膜增厚，促进肾脏纤维化[17-18]。综合黄芪-丹参药对组差异表达miRNA靶基因的KEGG通路富集分析结果，推测黄芪-丹参药对可能通过调节筛选出的差异表达miRNA，调控相关信号通路，从而发挥延缓高血压肾损害进程的作用。

近年来，随着精准医疗和大数据时代的蓬勃发展以及基因芯片、高通量测序等生物技术的广泛应用，与多种疾病发生、发展、诊治及预后相关的特定miRNA日益被发掘并予以鉴定，从而为阐明疾病的作用机制和调控网络提供新思路。本研究通过分别对对照组、模型组及黄芪-丹参药对组大鼠肾组织进行miRNA测序，构建各组间差异miRNA的表达谱，并预测相应的靶基因；应用生物信息学技术系统分析，筛选与黄芪-丹参药对干预高血压肾损害密切相关的miRNA靶点及调控通路，为高血压肾损害的机制研究和防治提供依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突