小檗碱通过下调miR-1290缓解高糖诱导的足细胞损伤研究

杨晶晶，沈宗姮，何沛原，刘玉萍*

1.四川省医学科学院·四川省人民医院，四川 成都 610000

2.四川省人民医院 健康管理中心，四川 成都 610000

糖尿病肾病是糖尿病常见并发症之一，属于慢性微血管病变，可导致终末期肾病。研究表明，足细胞数量减少可影响肾小球滤过屏障结构，进而影响肾功能；足细胞凋亡与氧化应激、炎性反应密切相关，减轻足细胞损伤可保护肾功能[1]。许多中药提取物及其活性成分具有抗炎、抗氧化等作用，可减轻高糖诱导的足细胞损伤[2-4]。小檗碱具有抗炎、抗氧化等作用，可抑制神经退行性疾病的发生及发展，并可通过作用于转化生长因子-β1（thansforming growth factor-β1，TGF-β1）/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）途径减轻高糖诱导的肾小球系膜细胞损伤[5]。miR-1290在糖尿病患者中表达升高，可能参与糖尿病的发生[6]。本研究采用高糖诱导足细胞建立细胞损伤模型，探讨小檗碱对高糖诱导的足细胞凋亡、炎性反应的影响，并探究及其对miR-1290的调控作用。

1 材料

1.1 细胞

小鼠肾足细胞MPC5购自上海通派生物科技有限公司。

1.2 药品与试剂

小檗碱（质量分数≥96%，批号HR1502）购自美国Sigma公司；DMEM培养基（批号12100046）、胎牛血清（批号10099）购自美国Gibco公司；Trizol试剂（批号15596018）购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂（批号4368813）、qRT-PCR试剂（批号11736051）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Lipofectamine 2000（批号20181213）、细胞凋亡试剂盒（批号20181116）购自北京索莱宝科技有限公司；白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒（批号20181003）购自上海臻科生物科技有限公司；IL-1β ELISA试剂盒（批号20181006）购自上海瑞番生物科技有限公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（批号20180906）购自南京森贝伽生物科技有限公司；阴性对照（miR-NC）、miR-1290模拟物（miR-1290 mimics）购自上海吉玛制药技术有限公司；兔抗鼠B淋巴细胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗体（批号sc-7382）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）抗体（批号sc-7480）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购自美国Santa Cruz公司；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（批号20181017）购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 仪器

FACS Calibur流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；StepOnePlus qRT-PCR仪（美国ABI公司）。

2 方法

2.1 细胞培养

MPC5细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞融合度达到80%进行传代培养。

2.2 小檗碱对MPC5细胞存活率的影响

取处于对数生长期的MPC5细胞，以2.5×105/mL接种于96孔板，培养12 h。设置对照组和小檗碱（1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L）组，各给药组加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，培养24 h。加入100 μL MTT溶液孵育4 h，弃上清，加入二甲基亚砜（DMSO），振荡至结晶完全溶解，采用酶标仪测定490 nm处的吸光度（A），计算细胞存活率。

细胞存活率＝A给药/A对照

2.3 小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响

取处于对数生长期的MPC5细胞，以2.5×105/mL接种于6孔板，培养12 h。设置对照组、模型组和小檗碱（1.0、2.5、5.0 μmol/L）组，模型组和各给药组加入含30 mmol/L葡萄糖的培养基，各给药组再加入相应药物，对照组加入含5.5 mmol/L葡萄糖的培养基，培养24 h[7-8]。收集细胞，加入预冷的PBS溶液洗涤，弃上清，加入500 μL Binding Buffer，分别加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶（PI），充分混匀，室温避光孵育10 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.4 小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞凋亡相关蛋白表达的影响

按“2.3”项下方法分组并处理细胞，收集细胞，加入RIPA裂解液，提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，加入上样缓冲液，沸水煮10 min使蛋白变性。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，室温封闭2 h，分别加入Bcl-2、Bax和GAPDH抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜；加入HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（1∶2000），室温孵育1 h，以TBST溶液洗涤，加入ECL发光液显影，采用Image J软件分析条带灰度值。

2.5 小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响

按“2.3”项下方法分组并处理细胞，收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书测定上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

2.6 小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞miR-1290 mRNA表达的影响

按“2.3”项下方法分组并处理细胞，收集细胞，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。将U6作为内参，引物序列：miR-1290上游引物5’-TGGATTTTTGGATCAG- GGA-3’，下游引物5’-CGCGTGGATTTTTGGATC- AGGGA-3’；U6上游引物5’-ATTGGAACGATAC- AGAGAAGATT-3’，下游引物5’-GGAACGCTTCA- CGAATTTG-3’。

2.7 miR-1290对小檗碱抑制高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响

取处于对数生长期的MPC5细胞，以2.5×105/mL接种于6孔板。设置小檗碱（5 μmol/L）＋miR-NC组、小檗碱（5 μmol/L）＋miR-1290 mimics组，待细胞分化成熟后，分别将miR-NC和miR-1290 mimics转染至细胞内，转染6 h后将培养基更换为含5 μmol/L小檗碱、30 mmol/L葡萄糖的培养基，培养24 h。收集细胞，按“2.3”项下方法检测细胞凋亡情况。

2.8 miR-1290对小檗碱调控高糖诱导的MPC5细胞凋亡相关蛋白表达的影响

按“2.7”项下方法分组并处理细胞，按“2.4”项下方法检测Bcl-2和Bax蛋白表达情况。

2.9 miR-1290对小檗碱抑制高糖诱导的MPC5细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响

按“2.7”项下方法分组并处理细胞，按“2.5”项下方法检测上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

2.10 统计学处理

应用SPSS 21.0软件分析数据，计量资料以±s表示且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 小檗碱对MPC5细胞存活率的影响

如表1所示，与对照组比较，小檗碱（10.0、20.0 μmol/L）组细胞存活率显著降低（P＜0.05），因此选择1.0、2.5、5.0 μmol/L小檗碱进行后续实验。

表1 小檗碱对MPC5细胞存活率的影响 ( ±s,n = 9)Table 1 Effect of berberine on survival rate of MPC5 cells ( ±s,n = 9)

表1 小檗碱对MPC5细胞存活率的影响 ( ±s,n = 9)Table 1 Effect of berberine on survival rate of MPC5 cells ( ±s,n = 9)

与对照组比较：*P＜0.05*P < 0.05 vs control group

组别 剂量/(μmol·L-1) 存活率/% 对照 — 100.00±4.09 小檗碱 1.0 98.76±4.82 2.5 99.75±5.14 5.0 94.63±5.47 10.0 86.28±2.54* 20.0 74.47±2.64*

3.2 小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响

如图1和表2所示，与对照组比较，模型组细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），Bax蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，小檗碱（2.5、5.0 μmol/L）组细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），Bax蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。

3.3 小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响

如表3所示，与对照组比较，模型组上清液IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，小檗碱（2.5、5.0 μmol/L）组上清液IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著降低（P＜0.05）。

图1 小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of berberine on apoptosis in MPC5 cells induced by high glucose

表2 小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响 ( ±s,n = 3)Table 2 Effect of berberine on apoptosis in MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

表2 小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响 ( ±s,n = 3)Table 2 Effect of berberine on apoptosis in MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05，表3、4同*P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs model group,same as tables 3,4

组别 剂量/(μmol·L-1) 凋亡率/% Bcl-2蛋白相对表达量 Bax蛋白相对表达量 对照 — 3.61±0.54 0.77±0.04 0.22±0.02 模型 — 25.17±2.10* 0.28±0.02* 0.69±0.03* 小檗碱 1.0 22.94±1.88 0.33±0.03 0.61±0.03 2.5 14.25±1.22# 0.52±0.04# 0.47±0.02# 5.0 7.14±0.69# 0.61±0.03# 0.35±0.02#

表3 小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响 ( ±s,n = 3)Table 3 Effect of berberine on IL-6,IL-1β and TNF-α levels in supernatant of MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

表3 小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响 ( ±s,n = 3)Table 3 Effect of berberine on IL-6,IL-1β and TNF-α levels in supernatant of MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

组别 剂量/(μmol·L-1) IL-6/(pg·mL-1) IL-1β/(pg·mL-1) TNF-α/(pg·mL-1) 对照 — 72.63±2.81 61.49±2.46 56.13±2.98 模型 — 227.34±8.77* 217.14±9.76* 265.74±12.62* 小檗碱 1.0 201.38±6.26 195.41±6.19 228.39±12.47 2.5 141.45±5.91# 136.43±2.03# 146.78±5.89# 5.0 104.28±3.49# 91.21±3.26# 85.34±3.32#

3.4 小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞miR-1290 mRNA表达的影响

如表4所示，与对照组比较，模型组细胞miR-1290mRNA表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，小檗碱（2.5、5.0 μmol/L）组细胞miR-1290mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）。

3.5 miR-1290对小檗碱抑制高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响

如图2和表5所示，与小檗碱＋miR-NC组比较，小檗碱＋miR-1290 mimics组细胞miR-1290mRNA表达水平显著升高（P＜0.05），细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），Bax蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。

表4 小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞miR-1290 mRNA表达的影响 ( ±s,n = 3)Table 4 Effect of berberine on miR-1290 mRNA expression in MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

表4 小檗碱对高糖诱导的MPC5细胞miR-1290 mRNA表达的影响 ( ±s,n = 3)Table 4 Effect of berberine on miR-1290 mRNA expression in MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

组别 剂量/(μmol·L-1) miR-1290 mRNA相对表达量 对照 — 1.01±0.06 模型 — 3.09±0.21* 小檗碱 1.0 2.83±0.15 2.5 2.13±0.12# 5.0 1.55±0.07#

3.6 miR-1290对小檗碱抑制高糖诱导的MPC5细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响

图2 miR-1290对小檗碱抑制高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of miR-1290 on berberine inhibiting apoptosis of MPC5 cells induced by high glucose

表5 miR-1290对小檗碱抑制高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响 ( ±s,n = 3)Table 5 Effect of miR-1290 on berberine inhibiting apoptosis of MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

表5 miR-1290对小檗碱抑制高糖诱导的MPC5细胞凋亡的影响 ( ±s,n = 3)Table 5 Effect of miR-1290 on berberine inhibiting apoptosis of MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

与小檗碱＋miR-NC组比较：*P＜0.05，下表同*P < 0.05 vs berberine + miR-NC group,same as below table

组别 miR-1290 mRNA相对表达量 凋亡率/% Bcl-2蛋白相对表达量 Bax蛋白相对表达量 小檗碱＋miR-NC 1.01±0.06 6.41±0.49 0.61±0.04 0.33±0.01 小檗碱＋miR-1290 mimics 2.45±0.09* 17.69±0.96* 0.38±0.03* 0.57±0.03*

表6 miR-1290对小檗碱抑制高糖诱导的MPC5细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响 ( ±s,n = 3)Table 6 Effect of miR-1290 on berberine inhibiting IL-6,IL-1β and TNF-α levels in supernatant of MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

表6 miR-1290对小檗碱抑制高糖诱导的MPC5细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响 ( ±s,n = 3)Table 6 Effect of miR-1290 on berberine inhibiting IL-6,IL-1β and TNF-α levels in supernatant of MPC5 cells induced by high glucose ( ±s,n = 3)

组别 IL-6/(pg·mL-1) IL-1β/(pg·mL-1) TNF-α/(pg·mL-1) 小檗碱＋miR-NC 109.44±3.43 86.65±3.82 92.72±2.86 小檗碱＋miR-1290 mimics 188.86±8.70* 169.67±6.26* 197.25±8.45*

如表6所示，与小檗碱＋miR-NC组比较，小 檗碱＋miR-1290 mimics组细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高（P＜0.05）。

4 讨论

足细胞损伤在糖尿病肾病发展过程中发挥重要作用，通过监测足细胞数量与形态的变化可预测糖尿病肾病的发生及发展。目前尚缺乏有效防治足细胞损伤的手段，研究发现，中药的活性成分具有减轻足细胞损伤的作用[9]。红景天苷能够通过上调血红素加氧酶-1的表达从而抑制高糖诱导的足细胞凋亡及氧化应激[10]；藏红花素能够通过抑制核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路，从而抑制高糖诱导的足细胞氧化应激及炎性反应[11]；小檗碱可减轻6-羟基多巴胺诱导的神经细胞损伤[12]；小檗碱可通过抑制炎性反应，有效改善肾脏缺血再灌注大鼠的肾功能[13]；小檗碱可抑制脂多糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞自噬，从而减轻细胞损伤[14]。本研究结果显示，经高糖诱导的MPC5细胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白表达水平升高，与文献报道一致[15]，提示足细胞损伤模型制备成功；小檗碱显著降低高糖诱导的MPC5细胞凋亡率，上调Bcl-2蛋白表达水平，下调Bax蛋白表达水平，提示小檗碱可抑制高糖诱导的足细胞凋亡；经高糖诱导的MPC5细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高，与文献报道一致[16]；小檗碱显著降低上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平，提示小檗碱可抑制高糖诱导的足细胞炎性反应。

本研究发现，高糖诱导的MPC5细胞miR-1290mRNA表达水平升高，小檗碱可显著降低miR-1290mRNA表达水平，提示小檗碱可能通过下调miR-1290表达从而减轻足细胞损伤。研究表明，miR-1290在糖尿病肾病患者中的表达升高，可能作为糖尿病肾病临床诊断的潜在生物学标记物[17]。为进一步探究小檗碱对高糖诱导的足细胞损伤的作用机制，采用过表达miR-1290联合小檗碱作用于高糖诱导的MPC5细胞，结果显示，MPC5细胞凋亡率升高，上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高，提示过表达miR-1290可明显逆转小檗碱对高糖诱导的足细胞凋亡及炎性反应的作用。

综上所述，小檗碱能够通过下调miR-1290表达，从而抑制高糖诱导的足细胞凋亡及炎性反应。miR-1290可作为小檗碱治疗糖尿病肾病的潜在靶点，但其具体作用机制尚需进一步探究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突