基于网络药理学及外周血基因芯片技术探究温阳益气活血方治疗慢性心衰的作用机制

吕李飞，吴俊松，苟江腾，赵成周，孙胜男，李忠宽，贾守宁，祁永福*

1.青海大学 青海省糖脂代谢疾病防控中医药重点实验室，青海 西宁 810016

2.生物芯片北京国家工程研究中心（博奥生物），北京 102266

3.青海大学藏医学院，青海 西宁 810001

4.青海省中医院，青海 西宁 810012

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是指各种心脏结构或功能异常，致使心室充盈或射血功能受损，心排血量不能满足机体组织代谢需要而引起的一组综合征，是多种心血管疾病主要死因。也是各种心血管系统疾病的最终转归，目前临床主要以神经内分泌调节治疗为主，如血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂（angiotensin receptor neprilysin inhibitor，ARNI）类药物，可抑制血管紧张素受体表达和增强利钠肽系统作用[1]。但究其根本为对症治疗，长期使用会产生耐药现象。目前CHF的病死率和复发率一直逐年增长，随着人口老龄化不断加剧，已成为我国主要的公共卫生问题，给社会经济造成严重负担[2]。

祖国医学将心衰归为“心水”“怔忡”范畴。西晋王叔和《脉经》提出“肝着其根，心气因起，阳行四肢，肺气亭亭，喘息则安。”其病理性质属本虚标实，本虚为心之气血阴阳虚衰，脏腑功能失调；标实为痰浊、瘀血、水饮、气滞。心气虚是病理基础，血瘀是中心环节，痰饮和水湿是主要的病理产物。据此，治以温阳益气活血法，方用温阳益气活血方治疗。

温阳益气活血方是青海省中医院名老中医自拟验方，由制附子、桂枝、黄芪、人参、熟地黄、当归、白芍、赤芍、川芎、桃仁、红花11味中药组成，具有温阳益气、活血化瘀之功效，使机体正存邪祛、阴阳乃固，故临床多用于心血管疾病，青海省中医院心肾科前期将温阳益气活血方进行临床研究，有明显临床疗效，后将其制成颗粒剂，目前对在院CHF患者应用广泛[3]。但中药复方是一种混合物，疗效的整体性体现在对人体全方位多靶点方面，因此从分子水平阐述温阳益气活血方防治CHF的作用机制是中药药理学亟待解决的重要问题，也是基础实验、临床研究获取理论依据的必经之路。网络药理学可整合中药成分与靶标间相互作用关系、靶标与靶标间相互作用关系；分子对接是预测受体与配体相互作用和反应机制的模拟化手段，二者联合应用有助于发现中药的潜在机制[4]。

目前温阳益气活血方改善CHF的效应机制尚不明确，本研究从外周血真核细胞基因表达谱的研究角度，采用芯片检测2种方法干预后，化学药组与中西药组外周血的差异表达基因，结合RNA的差异表达分析，初步判断基因表达的关键变化可能改变相关基因功能，为温阳益气活血方治疗CHF的作用机制提供研究资料和方向。

1 网络药理学实验

1.1 资料与方法

1.1.1 温阳益气活血方的潜在活性化学成分及靶点收集和筛选 从TCMSP数据库，依次检索白芍、赤芍、川芎等11味中药的化学成分，名称按《中国药典》2020年版的植物名称进行规范，根据化学成分的药动学参数进行筛选，参考TCMSP自设定意见的筛选条件[5]，通过筛选得到符合条件的潜在活性成分。另外，结合中国知网、维普、万方、PubMed等数据库及相关文献对未纳入的潜在化学成分进行补充。

1.1.2 CHF潜在作用靶点预测及筛选 从NCBI平台下的基因表达综合数据库（gene expression omnibus，GEO）以“chronic heart failure”为关键词，选择物种为“homo sapiens”，研究类型为“expression profiling by array”，检索CHF的基因芯片。选取基因芯片GSE9128（包含3个正常样本，样本编号为GSM231003、GSM231003、GSM231005；8个CHF样本，样本编号为（GS-M231006～GSM231013）及其平台数据GPL96下载后使用R软件包，设定P＜0.05和|log2（fold change，FC）|＞0.5，分别绘制热图与火山图。

1.1.3 “中药-成分-交集靶点-疾病”网络的构建 根据以上预测结果，使用Cytoscape 3.7.2软件构建“中药-成分-靶点-疾病”关系网络模型，节点（node）代表单味药种类、潜在活性化合物、共同作用靶点与疾病（CHF）；边（edge）用于连接中药与化合物、化合物与交集靶点、靶点与疾病（CHF）、疾病（CHF）与中药，展现“中药-化合物-交集靶点-疾病”之间的联系，寻找发挥重要作用的活性成分[6]。

1.1.4 蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建 PPI网络是指从生物化学、信号转导和遗传网络的角度研究化合物和疾病相关蛋白分子之间的相关性。将温阳益气活血方治疗CHF的潜在作用靶点导入STRING数据库（https://string-db.org/），限定研究物种为“homo sapiens”，获得PPI关系，导出保存为TSV格式文件。将该文件中包含node1、node2和combined score的信息导入Cytoscape 3.7.2软件绘制PPI网络[7]，设置节点的大小代表度（degree）值，节点越大，表示其度值越大，最终获得PPI网络图。

1.1.5 基因本体论（genetic ontology，GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 GO功能富集分析是对差异基因的生物途径进行注释及分类并进行富集统计学分析；KEGG通路富集分析是东京大学和京都大学共同研制的数据库，可查询通路[8]。将温阳益气活血方治疗CHF的潜在作用靶点导入David数据库，限定研究物种为“homo sapiens”，选择GO下的分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）和细胞组成（cellular component，CC）3个部分进行GO富集分析[9]，选择pathway分析下的KEGG pathway，设定显著性为P＜0.05，进一步寻找活性成分作用靶点显著富集的主要功能与体内通路。然后导出文件，对P值取负对数（-lgP），P值越小，-lgP越大，富集程度越大，反之亦然。利用R语言的Cluster Profiler工具包对GO分析和KEGG通路富集分析中的通路绘制条形图。

根据上述所得到的核心靶点、GO通路富集程度前15、5、13的信息以及KEGG富集程度前20的通路导入Cytoscape3.7.2，得到“靶点-BP-CC-MF- KEGG”网络。

1.1.6 核心活性成分-靶点分子对接验证 从RCSB蛋白质数据库（http://www.pdb.org/）下载5个核心靶标的晶体结构，去除水分子、加氢后使用Autodock Tool 4.2（ADT）保存为pdbqt格式。从TCMSP数据库下载6个核心成分的MOL2，并使用ChemDraw 3D软件将其能量最小化，再导入ADT后保存为pdbqt格式。采用Autodock Vina对6个核心成分与5个核心靶点进行分子对接验证[10]。用结合能来评估分子与靶点的结合能力，结合能＜0表明能自发结合，结合能≤-5 kJ/mol表明结合良好。

1.2 结果

1.2.1 温阳益气活血方潜在活性化合物筛选 从TCMSP数据库，在口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18[5]条件下，获取11味中药的138个有效成分（表1），包括并筛选得到有效成分所对应的236个靶点（剔除重复项后）。

表1 温阳益气活血方主要活性化合物筛选结果Table 1 Screening results of main active compounds in Wenyang Yiqi Huoxue Recipe

续表1

1.2.2 CHF潜在作用靶点 从GSE9128中获得395个差异基因（176个上调、219个下调），选择上调基因和下调基因各20个绘制热图（图1），其中C代表正常组，T代表CHF组。所有差异基因绘制火山图（图2），红色代表上调基因，绿色代表下调基因，黑色代表无显著性差异的基因。

1.2.3 交集靶点的获取 通过venny在线平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/toosls/venny/index2.0.2html），在sheet1输入成分靶点，sheet2输入CHF的差异基因，获取中药治疗CHF的17个交集靶点。将中药、成分、交集靶点及疾病导入Cytoscape进行“中药-成分-交集靶点-疾病”网络的构建。并通过Cytoscape分析得到编号为MOL000098、MOL000358、MOL000422、MOL000006、MOL000449、MOL002714的成分度值最大，为核心成分（图3），分别是槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、豆甾醇（stigmasterol）、黄芩素（baicalein），为温阳益气活血方筛选出的6个改善CHF的潜在核心活性成分。

图1 差异基因热图Fig.1 Thermal maps of differential genes

图2 差异基因火山图Fig.2 Volcanic maps of differential genes

1.2.4 PPI网络的构建 将交集靶点输入STRING数据库，构建PPI网络，再将结果以TSV格式导入Cytoscape进行分析。Cytoscape分析得到磷酸化原癌基因（Jun proto-oncogene，JUN）、白细胞介素1β（recombinant human interleukin-1 beta，IL1B）、前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）、Fos原癌基因（Fos proto-oncogene,AP-1 transcription factor subunit，FOS)、髓细胞增生蛋白（myelocytomatosisproteins，MYC）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）等靶点的度值较大，是核心靶点（图4）。

图3 “中药-成分-交集靶点-疾病”网络图Fig.3 Network diagram of “TCM-component-intersection target-disease”

图4 PPI网络Fig.4 PPI Networks

1.2.5 GO和KEGG富集分析 利用R语言的Cluster Profiler工具包，设置P＜0.05、q＜0.05进行GO和KEGG富集分析，根据矫正后P值筛选前20条进行作图。将前20条通路及通路所对应的靶点导入Cytoscape进行作图。

GO通路分析结果显示，BP富集基因程度包括：生热、对肌肉拉伸的反应、细胞对机械刺激的反应等；CC富集基因程度包括：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、蛋白激酶复合物、核染色质等；MF富集基因程度包括：R-Smad结合、E-box结合、RNA聚合酶II激活转录因子结合等（图5）。

KEGG富集分析共富集89条通路，结果显示温阳益气活血方治疗CHF的17个潜在作用靶点主要参与的关键通路是癌症的通路、C型凝集素受体信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）信号通路、催产素信号通路、慢性粒细胞性白血病、百日咳、军团菌病、人巨细胞病毒感染等[11]（图6、7）。

图5 GO分析“BP-CC-MF”图Fig.5 GO Analysis “BP-CC-MF”

图6 KEGG富集分析气泡图Fig.6 KEGG Air bubbles before enrichment analysis

1.2.6 分子对接验证 在“中药-成分-交集靶点-疾病”网络的构建分析中，通过Cytoscape分析得到排名前6的核心化合物是MOL000098（槲皮素）、MOL000358（β-谷甾醇）、MOL000422（山柰酚）、MOL000006（木犀草素）、MOL000449（豆甾醇）、MOL002714（黄芩素）。分子对接验证通过匹配原则算法模拟蛋白质与小分子受体相互作用。实验结果用结合能来评估分子与靶点的结合能力，配体与 受体结合能量越低，结合构象越稳定，相互作用的可能性越大，表明黄芩素与FOS的结合亲和力（binding affinity）为-38.49 kJ/mol，黄芩素与PTGS2为-38.49 kJ/mol，山柰酚与FOS为-40.17 kJ/mol，木犀草素与PTGS2为-38.91 kJ/mol。本研究结果显示温阳益气活血方的核心化合物与CHF共同靶点结合能均＜0，表明化合物与受体能自发结合，结合能≤-5 kJ/mol表明结合良好，小于-9 kJ/mol有较强的结合活性。分子对接的结合能结果见图8，其中活性化合物与受体分子有强烈结合的对接模式，见图9。结果证实温阳益气活血方与CHF的交集靶点蛋白有较好的结合活性。

图7 靶点-通路作用图Fig.7 Target-pathway action diagram

图8 分子对接能量图Fig.8 Energy of molecular docking

2 外周血真核细胞基因表达谱的试验研究

2.1 试剂与材料

2.1.1 试剂 真核生物多ARNA控制试剂盒（批号900433，100 rxns，Affymetrix，-20 ℃），扩增试剂盒（批号1792，100 rxns，Ambion，-20 ℃），真核生物杂交控制试剂盒（批号900454，30 rxns，Affymetrix，-20 ℃），杂交、洗涤、染色试剂盒（批号900720，30 rxns，Affymetrix，4 ℃）。

2.1.2 药物 盐酸贝那普利片（洛汀新片，批号H20054771，深圳信立泰药业公司），螺内酯片（批 号H42020343，武汉中联四药药业公司），氢氯噻嗪片（批号H20058629，山西云鹏制药公司），琥珀酸美托洛尔缓释片（批号H20100167，阿斯利康制药公司），地高辛片（批号AHG0335，杭州赛诺菲安万特公司），5%葡萄糖注射液（批号H1098300，江西科伦药业有限公司），温阳益气活血方颗粒剂（批号20010902，青海九康中药饮片有限公司）。

图9 分子对接模式图Fig.9 Molecular docking pattern

2.1.3 仪器 超净工作台（CJT-16，北京长城有限公司），微量台式离心机（5415D，Eppendorf公司），涡旋混合器（TDX-1，TonDa公司），移液器（P-2、P-20、P-200、P-1000，Eppendorf公司），离心管架（0.2 mL、0.5～1.5 mL，江苏三和金冠公司），冰箱（BCD-223N，美菱公司），制冰机（SIM-F124，三洋公司），PCR仪（PTC-225，MJ公司），Magnetic Stand-96（AM10027，Ambion公司），紫外分光光度计（ND-1000，NanoDrop公司），凝胶成像仪（GDS-7600，UVP公司），恒温金属浴（CHB-202，BIOER公司）；Hybridization Oven 640、Fluidics Station 450、GeneChip®Scanner 3000，均为Affymetrix公司。

2.2 方法

2.2.1 资料及临床研究 2018年11月—2020年5月，从青海省中医院招募的90名志愿者，分为对照组和试验组。对照组为青海省中医院治未病中心选取的30名健康人，安静状态下，采用抗凝管收集前臂静脉血，后随机抽取10例外周血用于有核细胞基因表达谱的差异检测。试验组为青海省中医院住部心肾科选取的60名符合《2018中国心力衰竭诊断和治疗指南》的患者（相应纳入、排除、脱落标准均参照该指南）[12]。将试验组60例CHF患者按随机数字表法分成化学药组和中西药组，2组各30例患者。临床研究经青海省中医院伦理委员会批准（编号为qhszyy1102201601），所有参与者在研究之前均签署知情同意书。

2.2.2 干预方法、标本采集及检测指标 对照组：为青海省中医院治未病中心选取的30名健康人，均经常规体检后在安静状态下，采用抗凝管收集前臂静脉血，后随机抽取10例外周血用于有核细胞基因表达谱的差异检测。化学药组：采用洛丁新片（10 mg/d）、氢氯噻嗪片（50 mg/d）、螺内酯片（40 mg/d）、倍他乐克片（23.75 mg/d）及地高辛片（0.125 mg/d）联合用药，每日1次，疗程为15 d；中西药组：在常规化学药口服治疗的基础上联合温阳益气活血方颗粒剂，6 g/次，2次/d，饭后30 min温服，疗程为15 d。药物干预前后对所有患者进行临床中医症状积分评估、纽约心功能分级、心脏彩超检查左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）[12-13]。安静状态下，采用抗凝管收集患者前臂静脉血，并

将标本分为2份，1份采用全自动化学发光测定仪检测血清脑钠肽前体（brain natriuretic peptide，BNP），另1份标记后存放在-80 ℃冰箱，最后随机抽取化学药组和中西药组中各5例治疗前后的外周血用于有核细胞基因表达谱的差异检测。

2.2.3 有效率分析 有效率评价标准参照国家药品监督管理局最新版《中药新药临床研究指导原则》[14]，将中医症状评分的“改善率”纳为“有效率”，，改善率＞67%、改善率介于25%～67%、改善率＜25%，分别定义为显效、好转及无效。

改善率＝(治疗前总分－治疗后总分)/治疗前总分

有效率=(显著＋好转) 例数/总例数

2.2.4 基因芯片表达检测 CHF患者在入院后次日清晨安静空腹状态下，健康对照组在清晨安静空腹状态下，采用抗凝管收集患者前臂静脉血，为减少样本的污染，优先采用其他采血管收集排出前1 mL血液。采用Affymetrix mRNA表达谱芯片检测样品的总RNA为起始，进行体外扩增和生物素标记，标记后进行芯片杂交、清洗、染色、扫描，使用AGCC软件分析芯片的荧光图像，结合生物信息学的转录组学及RNA技术分析温阳益气活血方的差异表达基因，本部分由北京博奥晶典生物技术有限公司完成。标记过程采用Ambion #1792 cRNA扩增标记试剂盒。实验流程主要包括以下步骤。（1）反转录合成First strand cDNA：以Total RNA起始，含有T7启动子序列的T7 Oligo（dT）Primer为引物，使用First Strand Enzyme Mix合成First strand cDNA。（2）合成Second strand DNA：用Second Strand Enzyme Mix将DNA-RNA杂合体中的RNA链转化为Second Strand cDNA，合成双链 DNA。（3）体外转录合成cRNA：以Second Strand cDNA为模板，利用T7 Enzyme Mix合成cRNA，掺入生物素biotin。（4）cRNA纯化：使用磁珠纯化cRNA，除去盐、酶等杂质，并对cRNA进行定量。（5）cRNA片段化：将cRNA片段化成适宜杂交的大小。（6）芯片杂交、清洗、染色、扫描。

2.2.5 差异基因的生物信息学分析 表达谱芯片分析温阳益气活血方的差异基因。使用KOBAS软件进行KEGG通路富集分析，差异表达基因分析设定P＜0.05和|log2FC|＞1.2为筛选条件。log2FC＞1.2表明基因表达上调；log2FC＜-1.2表明基因表达下调。

2.2.6 RNA差异表达分析 主要使用AGCC软件进行芯片清洗染色，后分析芯片的荧光图像，进行RNA差异表达分析，比较中西药组与化学药组治疗后的差异表达基因。P值取对数再取负值（-lgP），-lgP值越大说明miRNA显著性水平越高。

继新医疗改革政策的不断推进，医院财务管理的难度也逐渐增强，新医改是对医院财务人员一次严格的考验与磨砺，在“时间紧、任务重”的情况下直接反映出财务人员的业务素质水平与工作效率。在这个重要的时刻，财务人员除了要全面掌握新会计制度的内容，更要用心去理解相关业务的原理，财务会计和预算会计对同一经济事项该如何按新规定进行会计处理，涉及面之广变化之多光靠死记硬背是不行的，要从根本原理上去理解型记忆。例如：在平行记账法下，判断一笔经济业务对预算会计来说是否需要记账，关键是要辨别该项业务在收付实现制下能否确认收入，如果它的结余会影响到当年的收支，那么就要确认收入，反之不确认。

差异LncRNA与差异mRNA的筛选：比较中西药组与化学药组治疗后二者的差异表达。采用R语言包进行差异分析，获得差异倍数并取对数（log2FC）。差异LncRNA与差异mRNA的定义为：|log2FC|＞1.2且P＜0.05，将log2FC＞1.2定义为表达上调，log2FC＜-1.2定义为表达下调。

2.2.7 统计学分析 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，描述数据如年龄大小、病程长短等符合正态分布的数据均采用±s表示，各组治疗前后采用配对t检验，组间比较采用成组t检验。计数资料如男女比列、心功能分级采用χ2检验。若不符合正态分布，则采用非参数检验。检验水平α＝0.05，P＜0.05认为有显著性统计学差异，P＜0.01认为有极显著性差异。

2.3 基因芯片实验结果

2.3.1 一般临床资料比较 2组患者男女总数属正态分布，采用χ2检验，P＝0.432＞0.05，差异不具有统计学意义；2组患者年龄大小，属正态分布，使用独立样本t检验，P＝0.759＞0.05，差异不具有统计学意义；2组患者病程长短属正态分布，采用独立样本t检验，P＝0.883＞0.05，差异不具有统计学意义；试验组2组患者药物干预前心脏彩超LVEF值，使用独立样本t检验，P＝0.932＞0.05，差异不具有统计学意义。2组患者入院心功能分级采用χ2检验，P＝0.432＞0.05，2组差异无统计学意义。以上指标均具有可比性（表2）。

表2 两组患者一般资料比较 ( ±s)Table 2 Comparison of general data between two groups ( ±s)

表2 两组患者一般资料比较 ( ±s)Table 2 Comparison of general data between two groups ( ±s)

n/例 心功能/例 组别 男 女 年龄/岁 病程/年 治疗前LVEF/% II级 III级 化学药 14 16 77.00±8.92 7.83±3.79 60.73±9.62 14 16 中西药 11 19 76.30±8.66 7.97±3.16 60.93±8.55 11 19

2.3.2 血清BNP水平 试验组2组患者药物干预前后血清BNP水平均在正态分布范围内，治疗前采用独立样本t检验，P＝0.891＞0.05，差异不具有统计学意义；2组治疗后采用成组t检验，治疗前后t值不同，P＜0.01，表明差异有统计学意义，且15 d疗程后，血清BNP水平均下降，表明治疗有效。2组患者经15 d治疗后，血清BNP水平差异采用独立样本t检验，P＝0.041＜0.05，表明治疗后2组患者血清BNP水平有明显差异，且中西药组治疗效果优于化学药组（表3）。

2.3.3 中医症状积分 2组患者入院前中医症状积分比较采用独立样本t检验，P＝0.408＞0.05，两组差异无统计学意义；2组经15 d治疗后，治疗前后及组间中医症状积分疗效评价采用秩和检验，P＝0.037＜0.05，表明2组患者药物治疗后中医症状积分差异有统计学意义，且中西药组治疗效果优于化学药组（表4）。

2.3.4 心功能分级 2组患者经15 d治疗后，评价治疗前后心功能分级，疗效标准参考纽约心功能评价[14]。心功能疗效比较采用秩和检验，中西药组有效率为87%，化学药组为77%，P＝0.027＜0.05，表明2组患者药物治疗后心功能疗效差异有统计学意义，且中西药组治疗效果优于化学药组（表5）。

2.3.6 芯片杂交结果分析 2组不同药物干预后，外周血基因表达谱中15 886个基因表达上调（主要上调表达基因为ZNF331、TRAPPC10、SMAD7、MYC、RORA），26 754个基因表达下调（主要下调表达基因为RHOB、LRRN3）。结合网络药理学预测和|log2FC|，关键基因见表7。主要基因参与的富集信号通路见图10。初步证实Th17细胞分化、B细胞受体信号通路、AMPK信号通路是关键通路，与芯片上调基因相关，可揭示温阳益气活血方治疗CHF的作用机制。与网络预测的结果相符合。

表3 血清BNP水平 ( ±s)Table 3 Levels of serum BNP ( ±s)

表3 血清BNP水平 ( ±s)Table 3 Levels of serum BNP ( ±s)

与同组治疗前比较：**P＜0.01；与化学药组治疗后比较：#P＜0.05**P ＜ 0.01 vs same group before treatment; #P ＜ 0.05 vs chemical medicine group after treatment

组别 n/例 观察时间 BNP/(pg·mL-1) 30 治疗前 1 030.16±286.73 化学药 治疗后 572.01±180.14** 30 治疗前 1 041.76±359.59 中西药 治疗后 470.92±194.77**#

表4 中医症状积分比较 ( ±s)Table 4 Comparison of TCM symptom scores ( ±s)

表4 中医症状积分比较 ( ±s)Table 4 Comparison of TCM symptom scores ( ±s)

与同组治疗前比较：*P＜0.05；与化学药组治疗后比较：#P＜0.05*P ＜ 0.05 vs same group before treatment; #P ＜ 0.05 vs chemical medicine group after treatment

组别 n/例 观察时间 中医症状积分 30 治疗前 24.90±2.48 化学药 治疗后 13.57±4.22* 30 治疗前 25.57±3.61 中西药 治疗后 11.03±4.94*#

表5 心功能疗效比较Table 5 Comparison of cardiac function and curative effect

表6 两种药物干预后有效率比较Table 6 Comparison of efficacy of two drugs after intervention

2.3.7 RNA差异表达分析结果 Cluater采用归一化后的数据，聚类使用amap包的hcluster（method＝LinkMethod），绘图采用heatmap.2。化学药组、中西药组对比，绘制2组关键基因的mRNA、LncRNA热图（图11）。由图11表明，2组不同药物（化学药与中西药）干预后与关键基因（表7中的基因）的差异表达密切相关。

表7 关键基因的芯片验证Table 7 Microarray validation of key genes

构建ceRNA（LncRNA-miRNA-mRNA）网络：通过mircode数据库寻求差异LncRNA的靶基因miRNA，与自制芯片的miRNA取交集，再通过miRDB、miRTarBase、TargetScan数据库寻求相应的mRNA，与自制芯片的mRNA取交集，最后Cytoscape绘制网络图。miRNA富集度分析，若P值相同，miRNA富集度越大，表明该miRNA受到实验的影响越大；P＜0.01表示miRNA具有显著性差异。lncRNA的|log2FC|≥2及mRNA的|log2FC|≥2。

采用桑基图（图12）展示以miRNA为联系的LncRNA上游基因调控和mRNA下游基因调控。预测LncRNA干预CHF的主要基因包括：真核翻译延伸因子1α1（EEF1A1P25）、干扰素诱导酶1（GVINP1）、嗅觉受体家族（OR2A9P）。OR2A9P是G蛋白偶联受体成员，与鼻中气味分子相互作用，启动神经递质-激素受体反应，作用于心血管系统。预测的相关miRNA与芯片验证的关键基因相关：RHOB基因相关的miR-27a-3p可抑制血管内皮细胞的增殖、迁移，对血管重构具有保护作用；ZNF331的启动子区甲基化可诱导miR-140-5p对脂多糖介导的血管内皮细胞增殖及分化具有浓度依赖性，是心血管疾病早期效应标志物；MYC基因与血清miR-129-5p水平密切相关，血清miR-129-5p水平可预判CHF患者预后，与LVEF相关。因此，上述预测的miRNA和基因也可用于温阳益气活血方的质量控制及疾病标志物筛选，为CHF的治疗提供参考。

图10 治疗后化学药组与中西药组芯片上调基因信号通路富集分析Fig.10 Enrichment analysis of up-regulated gene signaling pathway in western medicine group and Chinese and western medicine group after treatment

3 讨论

传统温阳益气活血方为历朝经验集方，虽配伍各异，作用却殊途同归。其配伍原则如下：方中以附子、桂枝为君，附子善温肾中命门之火，张景岳（擅长用附子）也称之大能引火归元，可见附子温走三焦，其温性用之中的，便可妙不尽言。桂枝可认为是不典型的“补阳药”，又能入血分起温阳活血通滞之用。人参、黄芪、熟地黄为臣。人参规格繁多，本方最适合配伍红参，参经火制则阳气增，徐灵胎曾认为民生、医者皆滥用人参，但人参功效不可质疑，人参在培补元气之余又能扶正祛邪；佐配伍黄芪，一者助参治气虚之功，再者黄芪养血利水行滞助桂附益气化瘀；熟地补精填髓，为阳气化气提供能源物质基础。当归、白芍、川芎为佐。川芎乃血中气药，在活血同时兼理气作用，气行则血行；当归补血活血，一防血虚留瘀，二防行血伤血，另外防年高羸弱之人大便难；白芍使肝气柔和调畅，不亢盛，恶血不归于心，且兼酸甘化阴血之性。桃仁、红花、赤芍为使。桃仁性平，行血但不耗血，同时佐当归润肠通便；红花、赤芍一温一凉，互相制约，共奏活血之效。

图11 治疗后化学药组vs中西药组热图Fig.11 Heat map of western medicine group vs Chinese medicine group after treatment

图12 外周血基因芯片桑基图Fig.12 Sankey map of peripheral blood gene microarray

基因芯片技术分析表明，磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（phosphoinositide-3 kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）、AMPK通路是关键基因所富集的通路，三磷酸腺苷结合能是芯片GO差异分析的主要生物过程。腺苷酸活化蛋白激酶是丝氨酸/苏氨酸激酶在进化过程中的一种高度保守状态[15]，能启动人体线粒体开始产能代谢，有“能量代谢总开关”之称。其同源蛋白能参与真核生物细胞核的转录，也在介导的凋亡过程中被激活，因此被认为是凋亡的调节剂[16]。GO富集分析结果表明，温阳益气活血方的作用靶点在多种细胞组分中存在，并且以细胞质分布为主，以扩散-运输的结合方式参与多种经典生物进程。MAPK信号转导通路是一细胞内的经典通路（细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）[17]，其存在于大多数细胞内，从低等原核细胞至高等哺乳动物，在生物进化过程中有高度保守性，其将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并在引起细胞生物学反应（如细胞增殖、分化、转化及凋亡等）的过程中具有至关重要的作用。有实验研究证实CHF可通过激活MAPK和PI3K/Akt信号通路[18-19]，使肺动脉平滑肌细胞大量增殖，最终导致肺动脉高压[20]。

脂多糖是CHF的重要毒力因子，可诱导心肌细胞肥大，使心肌细胞体积增大[21]，心肌细胞骨架微丝密度增大，排列紊乱，其机制可能与Toll样受体4/核因子κB（Toll-like receptor4/nuclear factor-κB，TLR4/NF-κB）信号通路相关的炎症反应有关[22]。提示温阳益气活血方”能通过多靶点、多通路，在CHF中起到关键治疗作用。

Gui等[23]研究证实可通过AMPK信号通路上调自噬，抑制游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）的游离脂代谢，降低低氧环境下肺动脉平滑肌细胞诱导增殖的可能。有实验数据显示，在24 h缺氧密闭的大鼠肺动脉平滑肌细胞培养液中，添加高浓度FFA液，AMPK在内质网中翻译的活性被抑制，而抗磷脂综合征（antiphospholipid syndrome，APS）能促进FFA被摄取利用，降低FFA在培养液中的浓度，而APS能降低CHF死亡风险，已被广泛证实，CHF患者晚期不仅存在高FFA上限水平，而且也存在FFA融合利用障碍。CHF的血液循环多瘀，导致心肌细胞内FFA蓄积、ATP减少。

杨冬花等[24]研究发现，温阳益气活血方能通过抑制β3-肾上腺素受体（β3-adrenoceptor agonists，β3-AR）的表达减少I型前胶原羧基端原肽（type I procollagen carboxyl terminal propeptide，PICP）和III型前胶原氨基端肽（procollagen IIIN-termi，PIIINP）含量，逆转心室重塑，从而改善心脏功能。李春陵等[25]探讨温阳益气活血方通过抑制GATA结合蛋白4（GATA binding protein4，GATA4）的表达减少I型胶原含量，降低I型/III型胶原值，逆转心室重塑，改善心脏功能。综上所述，温阳益气活血方对CHF心室重塑是通过调控β3-AR、血清I型、III型胶原含量来控制LVEF、左心室收缩末期内径（left ventricular end systolic dimension，LVESD）、左心室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter，LEVDD）等主要效果指标，并且观察组与对照组治疗前后的实验结果发现，观察组总有效率明显高于对照组（P＜0.05）；治疗后，观察组的LVEF指标显著高于对照组，观察组的LVESD、LVEDD均低于对照组（P＜0.05）。张聪聪等[26]探讨温阳益气活血方通过化痰作用将转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/ Smads信号通路与肺动脉压力相联系并且起到调控的作用。

脂肪酶移位酶（fatty acid translocase，FAT）/ CD36T和肉毒碱棕榈酰转移酶-1（carnitine palmitoyl transterase-1，CPT-1）是2个参与FFA转运的关键酶[27]，与心肌、骨骼肌产能也密切相关。CD36是多种组织细胞膜上的糖蛋白，也是心脏FAT的主要形式。另外，分布于胞浆中的是FAT/CD36，CPT-1主要在线粒体膜上分布，其表达增加可促使FFA的跨膜运输，进而线粒体氧化ATP增加，而CD36类似一种跨膜运输反应的媒介催化剂，可加速FFA的摄取。但研究发现CHF时，上述2种关键酶均减少或者活性被抑制而降低，最终致使FFA的摄取和利用率障碍[28]。

可见APS在充分能抑制AMPK通路活性的情况下，FAT/CD36T和CPT-1的膜转位表达，也受抑制，因此AMPK与2个关键酶存在共线关系，彼此间的活化或抑制是一种充分必要条件。因此改善APS成为CHF一种有前景的治疗手段，APS催化CD36跨膜反应使心肌加大对FFA的摄取，从而心肌代谢底物的结构被改造，可能是“胚胎化”代谢底物的一种同分异构体，最终底物逆向化状态被打破，进而改善CHF相关症状。

而研究者通过提取具有益气活血功效的中药化学成分作用AMPK信号通路时[29]，发现心肌细胞对FFA的利用率提高，心肌细胞的ATP代谢从最初的糖酵解和乳酸氧化反应逐渐转变为以脂肪酸氧化代谢为主导。这就是“逆向化状态被打破”，同时其对肺动脉平滑肌细胞的大量增殖有逆转作用，使肺动脉压力降低，延缓肺血管重构。细胞增殖的中断对低氧性肺动脉高压有扭转作用，甚至使病理机制改变，减轻肺血管阻力[20]。

又有研究者证实，红景天联合温阳益气活血方对低氧环境下心衰大鼠模型的肺动脉血管平滑肌细胞的诱导增殖有保护作用，温阳益气活血方类似于AMPK信号通路活化剂[30]。结果表明，红景天单方、温阳益气活血方、加味红景天方皆可通过AMPK通路逆转肺动脉平滑肌细胞的增殖和胰岛素抵抗，减少胰岛细胞的损伤凋亡，加速心肌细胞对葡萄糖的利用[31]。最终证实红景天单方、温阳益气活血方、加味红景天方对CHF有治疗作用。

miRNA是单链的非编码小RNA，通过碱基互补配对原则将mRNA的3’或5’UTR区与特定靶基相结合，可直接降解mRNA或抑制相关蛋白质的翻译过程，因此miRNA与疾病的发生、发展是密切相关的[32-33]。是多种生物过程的重要调控因子，如细胞重编程、增殖、凋亡、迁移等过程，miRNA在心肌细胞炎症反应中参与重要调节功能。笔者通过自制Affymetrix mRNA芯片进行差异性分析，关键miRNA的筛选，并将LncRNA最具功能性的基因对温阳益气活血方治疗CHF的mRNA核心基因进行调控。芯片筛选出的miR-140-5p表达随脂多糖浓度的增高而降低[34]，脂多糖介导的KCNQ1重叠转录物1（KCNQ1 overlapping transcript 1，KCNQ1OT1）参与血管内皮细胞迁移的调控，KCNQ1OT1通过竞争内源RNA抑制蛋白络氨酸磷酸酶IVA型成员3（proteintyrosine phosphatase type IVA,member 3，PTP4A3）所介导的MAPK、PI3K/Akt信号通路[35]，这与芯片所富集出的通路相一致，miR-140-5p可作为CHF早期干预治疗的效应标志物；miR-27a-3p抑制血管内皮细胞HUVECs，进而抑制主动脉中膜弹力纤维和胶原纤维的生成，影响血管重构，对CHF具有保护作用[36]；miR-129-5p可通过Wnt5a信号通路调节血管平滑肌[37]，而Wnt5a信号通路在自制芯片中参与差异改变，miR-129-5p可介导Wnt5a通路调节血清骨桥蛋白对炎症的反应，诱导心肌细胞IL-17大量聚集[38]，减少脂蛋白受体摄取脂质，这也证实了网络药理学富集的IL-17通路是重要通路。CHF的心功能恶化症状与心肌细胞炎症反应密切相关，进而减少炎症反应发生。

综上所述，可通过多层次、多通路、多靶点导致CHF的发生、发展，因此对于CHF的治疗需要通过中药组合的协同靶向作用，即多成分-多途径-多靶点的发挥联合治疗作用。大数据的挖掘可节约科研成本，课题组将对关键基因、通路进行RT-PCR及Western blotting实验验证。现从网络药理学理论出发将温阳益气活血方的药物作用趋向与CHF靶标加以联系分析，同时经CHF患者外周血基因芯片验证，以期能进一步挖掘对CHF治疗的潜在干预靶标与作用机制[39]，为中医药治疗疑难疾病的临床研究和新药研制开发提供坚实理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突