山茱萸萜类甲羟戊酸合成途径关键酶CoHMGS基因的克隆与分析

侯典云，王瑶瑶#，刘晓冉，张佳琪，马占强，胥华伟，王笑尘

1.河南科技大学农学院，河南 洛阳 471023

2.洛阳市道地药材繁育与创新利用工程技术研究中心，河南 洛阳 471023

3.南阳市山茱萸研究所，河南 南阳 474550

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥果肉，是我国传统名贵药材，具有补益肝肾、收涩固脱等功效[1]。山茱萸的主要成分有环烯醚萜类、鞣质类、黄酮类、三萜类、苯丙素类等，还包含多种对人体有益的其他物质[2]。现代药理学研究认为山茱萸具有抗肿瘤[3]、抗氧化[4]、抗炎症[5]、护肝[6]、降血糖[7]等生物学活性，具有较好的开发应用前景。

植物体内的萜类有2条合成途径：1条是甲羟戊酸途径，在细胞质中发挥作用；另1条是发现较晚的甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径，定位在质体[8]。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶（HMGS）是甲羟戊酸途径的关键酶，作用于该途径的第2步反应，催化一分子乙酰乙酰辅酶A和一分子乙酰辅酶A缩合生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A[9]，接着进行后续反应生成相应的萜类物质。HMGS对萜类物质的生物合成至关重要，备受关注，近年来在银杏[10]、牛樟芝[11]、桑黄[12]、陆英[13]、灵芝[14]和丹参[15]等药用植物上均有研究，但在山茱萸中未见报道。

在山茱萸转录组中，通过分析目前只发现了c102453_g2[16]这1个HMGS基因，利用primer premier 5.0软件设计引物，采用RT-PCR技术扩增CoHMGS基因，通过生物信息学分析软件初步探讨CoHMGS编码蛋白质的特征信息，为进一步研究山茱萸体内甲羟戊酸生物合成途径奠定基础。

1 材料与试剂

1.1 材料

植物材料经河南科技大学农学院侯典云教授鉴定为山茱萸C.officinalisSieb.et Zucc.植株。采集山茱萸树上完整无病虫害且生长状态基本一致的叶片和果实若干，摘下后立即用蒸馏水冲洗干净，放进事先准备的1.5 mL离心管内，置于液氮速冻，最后转移到-80 ℃冰箱保存。

1.2 试剂

RNA提取试剂盒（北京天根有限公司，编号：DP441）；cDNA反转录试剂盒、2×Long Taq Master Mix、零背景pTOPO-TA克隆载体购自艾德莱生物科技公司；DNA纯化回收试剂盒（南京诺维赞有限公司）；感受态的大肠杆菌DH10B（自制）。

2 方法

2.1 引物合成

根据c102453_g2序列设计山茱萸HMGS基因的扩增引物，引物具体序列为CoHMGS-F：5’-GGAGCTAGTGACAGAAAGA-3’和CoHMGS- R：5’-CTGGCAGAATGAGGAACA-3’。

2.2 山茱萸RNA的提取和cDNA的合成

山茱萸叶片用液氮研磨，根据RNA提取试剂盒说明书操作，获得山茱萸总RNA。通过1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop检测RNA的提取质量和浓度。

2.3 CoHMGS基因克隆与测序

以山茱萸总RNA反转录得到的cDNA为模板，设置25 μL PCR扩增体系：1 μL CoHMGS-F引物、1 μL CoHMGS-R引物、1.5 μL cDNA、12.5 μL 2×Long Taq Master Mix、9 μL ddH2O；CoHMGS基因PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，32个循环；72 ℃终延伸10 min。电泳观察扩增结果，切胶纯化回收目的片段，连接到pTOPO-T载体上形成重组质粒，再通过热激法将重组质粒转化进大肠杆菌DH10B中，加入无菌液体LB（Luria-Bertani）培养基振荡培养60 min左右，浓缩菌液涂布于氨苄抗性的LB平板，选取单菌落摇菌6 h以上，菌液PCR挑选条带正确的菌液送公司测序。

2.4 生物信息学分析

在NCBI数据库对CoHMGS基因进行Blast和保守结构域分析，通过Cell-Ploc 2.0在线预测CoHMGS基因编码蛋白质在细胞内的具体位置，利用ExPASY analysis分析CoHMGS基因编码氨基酸的特征，使用TMHMM Server推测蛋白质的跨膜结构信息，用MEGA 5.0软件对山茱萸HMGS编码的蛋白质进行聚类分析，构建系统发育树。

3 结果与分析

3.1 CoHMGS基因克隆与测序

图1 CoHMGS的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of CoHMGS

CoHMGS基因的PCR反应产物电泳检测结果表明：PCR扩增获得一条单一亮带（图1）。回收纯化，然后连接到克隆载体pTOPO-T上，转化感受态细胞DH10B，经菌落PCR鉴定，挑选阳性菌液送公司测序，获得长度为1645 bp的序列，经比对确认为CoHMGS的cDNA序列。

3.2 CoHMGS保守结构域分析

对测序得到的DNA序列在NCBI数据库进行Blast分析，结果显示山茱萸CoHMGS基因序列和喜树、人参、三七和杜仲等植物的HMGS基因序列相似程度均在90%以上。结果表明，山茱萸CoHMGS蛋白属于PLNO2577超家族，是羟甲基戊二酰辅酶A合酶（图2）。

3.3 CoHMGS亚细胞定位预测

利用相应工具确定CoHMGS的开放阅读框和编码的氨基酸序列。通过Cell-Ploc 2.0在线软件进行亚细胞定位预测结果显示：CoHMGS基因编码蛋白质定位于细胞质内（图3）。

图2 CoHMGS蛋白的保守结构域Fig.2 Conserved domains of CoHMGS protein

图3 CoHMGS蛋白亚细胞定位预测Fig.3 Prediction of CoHMGS protein subcellular location

3.4 山茱萸CoHMGS编码蛋白的特性分析

ExPASy在线分析结果表明CoHMGS编码蛋白的相对分子质量为51 875.8，分子式为C2304H3555N605O705S27，理论等电点6.13；丝氨酸数量最多，占比9.8%，负电荷氨基酸共52个，正电荷氨基酸共46个，蛋白整体带负电荷；预测是不稳定亲水性蛋白。TMHMM Server在线分析结果显示：山茱萸CoHMGS蛋白没有跨膜结构，是一个膜外蛋白（图4）。

3.5 山茱萸CoHMGS蛋白的结构预测

通过SOPMA在线预测山茱萸CoHMGS蛋白的二级结构（图5），包括α-螺旋占43.62%，无规则卷曲占40.64%，自由延伸占12.55%，β-转角占3.19%。由SWISS-MODEL预测得到该蛋白的三级结构模型（图6）。

3.6 山茱萸CoHMGS氨基酸序列同源分析

图4 CoHMGS蛋白跨膜结构域预测Fig.4 CoHMGS protein transmembrane domain prediction

图5 CoHMGS蛋白二级结构Fig.5 Secondary structure of CoHMGS protein

图6 CoHMGS蛋白三级结构Fig.6 Tertiary structure of CoHMGS protein

多序列比对分析结果表明山茱萸CoHMGS序列与山梨猕猴桃Actinidia rufaPlanch.的HMGS序列一致性为90.45%、中华猕猴桃Actinidia chinensisPlanch.为90.02%、三七Panax notoginseng(Burkill) F.H.Chen ex C.H.为90.43%、茶Camellia sinensis(L.) O.Ktze.为90.23%、喜树Camptotheca acuminateDecne.为88.75%、人参Panax ginsengC.A.Meye.为90.21%、榴莲Durio zibethinusMurr.为90.32%、可可树Theobroma cacaoL.为89.46%、阿育魏实Trachyspermum ammi(L.) Sprague.为88.82%、杜仲Eucommia ulmoidesOliver.为90.39%。使用MEGA 5.0软件构建山茱萸CoHMGS与其近缘物种的系统进化树（图7），说明山茱萸HMGS与喜树、杜仲、山梨猕猴桃和中华猕猴桃的同源性较近，三七、人参等植物的HMGS与山茱萸同源性较远。

4 讨论

图7 CoHMGS蛋白的NJ系统进化树Fig.7 NJ phylogenetic tree of CoHMGS protein

近年来，随着研究的深入，许多萜类物质及其 衍生物的活性被解析，成为治疗诸多疾病的关键成分之一，如能够有效治疗肿瘤的紫杉醇，被誉为天然抗癌药物，是一种二萜生物碱类化合物[17]；可以抑制疟疾的青蒿素，是目前为止发现的治疗疟疾耐药性最好的药物，属于倍半萜内酯化合物[18]；明显减轻心绞痛，长期服用无明显不良反应，有效缓解冠心病症状的丹参酮[19]等。这些天然的中药活性物质成分安全，对人体危害性小，是不可多得的健康药物，但是植物的次生代谢产物往往具有种类丰富、产量偏低的特点。因此，通过解析萜类物质的生物合成途径，从分子水平定向改造植物来提高特定次生代谢产物含量是十分必要的。

甲羟戊酸途径（MVA pathway）是植物生成萜类物质的重要途径，主要生成倍半萜和三萜类物质[20]。HMGS广泛存在于高等植物体内，是MVA途径中的第2种酶，在有些植物体内HMGS有多个家族成员，Alex等[21]于2000年发现了存在于芥菜中的4个HMGS基因，随后有研究者发现在巴西橡胶树内存在2个HMGS基因[22]。研究表明，HMGS基因在植物的不同部位以及发育的不同时期的表达具有明显的差异性，并且作为MVA途径中的关键酶，影响多种植物发育模式的改变和次生代谢产物的生成[23]。将HMGS在雷公藤悬浮细胞中的差异表达，结果表明：过表达TmHMGS可提高MVA途径和MEP途径下游基因的表达量和二萜类化合物雷公藤甲素的含量，RNA干扰会降低MVA途径和MEP途径下游的基因表达量[24]。外源激素处理银杏叶片，发现在合适的激素浓度和处理时间下水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯都能不同程度地提高GbHMGS的表达量，同时也提高了银杏叶片中萜烯三内酯的总含量[10]。通过在番茄幼苗中过表达芥菜HMGS基因（BjHMGS1），可以明显地提高萜类物质合成途径MVA途径中HMGS上下游基因的表达量，并且也会影响MEP途径中相关基因的表达，从而提高转基因番茄果实中萜类物质（类胡萝卜素、角鲨烯）、α-生育酚以及一些植物甾醇的含量[25]。上述研究均表明HMGS基因在植物体内合成萜类物质的重要性。

山茱萸作为重要的中药材，其经济价值、生长习性和活性因子等方面得到了很大程度的开发，以山茱萸作为主要成分的中成药和保健品种类丰富，然而从分子水平上探究山茱萸活性成分生物合成途经的研究较少。本研究在高通量转录组测序的基础上，首次克隆出山茱萸HMGS基因的全长cDNA序列，并对山茱萸HMGS蛋白的基本特征和功能分析预测，为进一步揭示山茱萸萜类物质生物合成途径的分子机制奠定了基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突