虎掌南星超快速Real-time VPCR闭管检测方法的建立及应用

陈 蓉，余佳文，徐瑞超，唐 卓

1.成都中医药大学 民族医药学院，四川 成都 611137

2.太极集团重庆涪陵制药厂有限公司，重庆 408000

3.中国科学院成都生物研究所 天然产物中心，四川 成都 610041

虎掌南星又名掌叶半夏，是天南星科半夏属植物掌叶半夏Pinellia pedatisectaSchott的干燥块茎，具有燥湿化痰、祛风止痉、散结消肿等功效[1]。虎掌南星目前为非药典品种，但是被部分省地方标准收载品种[2-3]。半夏是一味常用中药材，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效。《中国药典》2020年版规定半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.) Breit的干燥块茎。由于半夏的市场需求量较大，价格高，市场上半夏药材的掺伪现象比较常见，其中最常见的伪品为虎掌南星[4]。个小的虎掌南星与半夏在形态上极为相似，经过加工炮制之后更加难以区分。所以建立虎掌南星特异性的鉴别方法对虎掌南星药材和半夏药材的质量评价以及2种药材的临床使用都具有十分重要的意义。

利用DNA分子鉴定技术可以实现对中药材及其成药当中原料药的真伪鉴定[5-9]，从2010年至今，历版《中国药典》先后收载了包括乌梢蛇[10]、蕲蛇[10]、霍山石斛[11]、金钱白花蛇[11]在内的多个中药材的聚合酶链式反应鉴别法。《中国药典》2020年版还新增了《聚合酶链式反应（PCR）法》[12]和《DNA测序技术指导原则》[12]，为DNA分子鉴定技术应用于中药材真伪鉴定的推广应用奠定了基础。实时荧光PCR（Real-time PCR）技术是在PCR扩增过程当中，通过荧光信号，对PCR过程进行实时监测的一种技术。该技术的整个过程不需要开盖，在最大程度上避免了PCR扩增产物的污染，同时由于该技术是一种实时监测技术，相比于传统琼脂糖凝胶电泳的终点检测可以节约大量的人力成本和时间成本，非常适用于大量样本的快速检测，目前已经广泛应用于临床病原微生物[13]、转基因产品[14]、肉类产品[15]的真伪鉴定等多个领域，2019年底爆发至今的新型冠状病毒的核酸检测也大都采用此法。

目前常规的RT-PCR操作采用PCR传统的三步法或两步法，整个扩增检测时间约为1 h，本课题组在前期的研究中发现，PCR过程中的变性、退火、延伸3个步骤不是一定要在传统的3个温度点且保持一定时间才能完成，而是可以在一个动态的变温过程中实现，即体系的温度只需要在2个温度点之间来回变化，就可以实现核酸的快速扩增[16]。由于该快速核酸扩增方法省略掉了在3个温度点的停留时间，整个核酸扩增的时间将大幅度缩短，同时由于该体系中温度对时间的曲线图会呈现多个重复的“V”字型，因此将上述快速核酸扩增方法取名为“VPCR”。前期研究还证明了VPCR技术可以应用于实时荧光监测的聚合酶链式反应，取名为“Real-time VPCR”。使用Real-time VPCR技术同样可以将核酸扩增检测的时间从1 h以上缩短至20 min左右。所以，本实验采用Real-time VPCR技术，建立了虎掌南星特异性的快速鉴别方法，可以在24 min内完成扩增检测，以期为虎掌南星以及半夏药材的质量控制提供参考。

1 材料和仪器

1.1 材料

特异性研究使用的虎掌南星P.pedatisecta、半夏P.ternata、水半夏Typhonium flagelliforme(Lodd.) Blume和天南星Arisaema erubescens(Wall.) Schott由太极集团提供，经太极集团余佳文总工程师鉴定以及ITS序列测序鉴定无误；用于盲测的7批药材采集自甘肃西和（编号1）、甘肃清水（编号2、3）、河北安国（编号4）、四川成都（编号5、6）、江西赣州（编号7），每批8个样本（a～h）。Easy Taq DNA聚合酶（货号AP111）、Trans2K DNA Marker（货号BM111-01）、dNTPs（货号AD101-12）均购自北京全式金生物技术有限公司；GELVIEW（货号EP1501）购于北京百泰克公司；琼脂糖粉（货号TSJ001）购于北京擎科新业生物技术有限公司；引物（HAP纯化)、荧光探针（HPLC纯化）均订自生工生物（上海）技术有限公司；植物基因组DNA提取试剂盒（货号DE-06113）购自成都福际生物技术有限公司；基于拓扑异构酶的超快速克隆试剂盒（货号C601-01）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 仪器

Thermo Shaker恒温仪（杭州博日公司）；Legend Micro 21R离心机（美国Thermo公司）；荧光定量PCR仪（Thermo Scientific PikoReal Real-Time PCR System）；电泳系统（北京六一仪器厂）；Typhoon FLA 7000 IP琼脂糖凝胶成像系统（GE公司），ND5000超微量紫外可见分光光度计（百泰克公司）。

2 方法

2.1 DNA提取

采取商品化的植物DNA提取试剂盒（柱式）对样本的DNA进行提取：取样时采用一次性刀片切去样品表面部分，刮取中间部分5～10 mg置于1.5 mL离心管中，按照植物DNA提取试剂盒说明书操作步骤进行DNA提取。所提取的DNA经超微量紫外可见分光光度计测量纯度和浓度，除特殊说明外，DNA模板均稀释至10 ng/μL进行使用。

2.2 Real-time VPCR扩增

以“2.1”项下制备的DNA作为模板，采用虎掌南星特异性引物HP1（5’-GGGAGAC- TCCTGACGATCGGC-3’），HRP1（5’-CCACGCAG- GCCATCACTTGAT-3’），以及TaqMan探针HP（5’-FAM-CGTGGGCCGGCGGGACGAC-3’-BHQ1）进行扩增和检测。反应体系：10×Taq buffer 2.5 μL；EasyTaq酶2个单位；正反向引物各0.6 μmol/L；TaqMan探针0.3 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L；MgCl22 mmol/L；DNA提取液1 μL；加灭菌水补足20 μL。扩增程序为95 ℃解链30 s；94 ℃变性0 s，60 ℃ 0 s，FAM通道荧光采集，循环40次。

2.3 ITS序列扩增与测序

以“2.1”项下制备的DNA作为模板，采用ITS通用引物ITS 5a fwd（5’-CCTTATCATTTAG- AGGAAGGAG-3’），ITS 4 rev（5’-TCCTCCG- CTTATTGATATGC-3’）进行扩增和检测。反应体系为：10×Taq buffer 2.5 μL；EasyTaq酶2个单位；正反向引物各0.1 mmol/L；dNTPs 0.2 mmol/L；DNA提取液1 μL；加灭菌水补足20 μL。扩增程序为95 ℃解链30 s；94 ℃变性5 s，50℃ 5 s，72 ℃ 30 s，循环35次。扩增产物送至生物公司采用上述通用引物进行双向测序。

2.4 琼脂糖凝胶电泳

PCR或者Real-time VPCR扩增结束后，取扩增产物5 μL与1 μL上样缓冲液进行混合，将混合液加至经GELVIEW染色的琼脂糖凝胶进行电泳分离，分离电压150 V，电泳时间10 min；电泳结束后，将该凝胶置于琼脂糖凝胶成像系统进行观察并拍照。

2.5 Real-time VPCR扩增产物的测序和比对分析

利用“基于拓扑异构酶的超快速克隆试剂盒”，按照试剂盒操作说明：将Real-time VPCR扩增产物连接至载体，并将该载体转化至感受态细胞，再将感受态细胞进行放大培养后涂板，待肉眼可见克隆长出时，挑取单克隆交由生物公司采用M13通用引物M13F（5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’）进行测序。所测得序列在Genbank BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）网站进行比对分析。

2.6 真实样本测序鉴定

真实样本检测中，将在Real-time VPCR快速扩增体系中显示阳性结果的扩增产物送至生物公司，利用虎掌南星特异性引物HP1（5’-GGGAGACT- CCTGACGATCGGC-3’）直接进行测序，测序序列在Genbank BLAST网站进行比对分析，测序结果与数据库中虎掌南星序列（AF469040.1）一致者判断为虎掌南星样本；对于在Real-time VPCR快速扩增体系中显示阴性结果的样本，取其DNA提取液，按照已报道文献所述方法[17]进行扩增，扩增结束后将扩增产物送至生物公司，利用文中所报道半夏特异性引物BP3（5’-GGGAGACTCCCGACGATCG- CA-3’）直接进行测序，测序序列在Genbank BLAST网站进行比对分析，测序结果与数据库中半夏序列（AF469036.1）一致者判断为半夏样本。

3 结果与分析

3.1 序列分析以及引物和探针的设计

通过对ITS序列部分进行扩增和测序的方式得到虎掌南星、半夏、天南星以及水半夏的ITS序列，并将所获得的序列与Genbank中已知序列相对比，发现所测得序列与Genbank中所登记序列一致（虎掌南星序列登记号为AF469040.1，半夏序列登记号为AF469036.1，水半夏序列登记号为AM777883.1，天南星序列登记号为JF975897.1。）采用序列比对软件将四者的序列进行比对，比对结果发现虎掌南星与天南星和水半夏的序列差异较大，相似度约为78%；虎掌南星与半夏由于属于同科同属植物，序列相似性高达92%。根据前期的研究经验以及引物和TaqMan探针设计原则，将差异碱基放至引物和探针的3’端，设计出核酸扩增所需要的引物和探针（图1）。

图1 虎掌南星及其近缘品种ITS序列分析Fig.1 Sequence alignments of ITS (partial sequence) from P.pedatisecta and its closely related species

3.2 Real-time VPCR体系的建立和优化

按照Real-time VPCR的操作[19]，分别对引物浓度和探针浓度进行了优化，如图2-A所示，引物浓度在0.2～0.6 μmol/L，随着引物浓度增加，Ct值从26.12降至20.99，但是当引物浓度从0.6 μmol/L升至1 μmol/L的过程中，Ct值变化不大，同时由于过高的引物浓度可能导致非特异性扩增的产生，故将引物浓度设定为0.6 μmol/L。在探针浓度方面，如图2-B所示，当探针浓度从0.1μmol/L升至0.3 μmol/L的过程中，Ct值从21.66降低至20.85，但是当探针浓度从0.3 μmol/L升至0.5 μmol/L的过程中，Ct值变化不大，所以将探针浓度设定为0.3 μmol/L。所以最终确定在20 µL的反应体系中，优化后引物浓度为0.6 μmol/L；探针浓度为0.3 μmol/L，反应程序为95 ℃解链30 s；94 ℃、0 s，60℃、0 s，FAM通道荧光采集，循环40次。总反应时间为24 min。

图2 引物 (A) 和探针 (B) 浓度优化Fig.2 Optimization of primers (A) and probes concentration (B)

3.3 虎掌南星Real-time VPCR体系特异性和准确性考察

利用虎掌南星Real-time VPCR检测体系对虎掌南星、半夏、水半夏以及天南星的基因组DNA进行扩增和检测，从而考察所建立体系的特异性，荧光扩增结果如图3-A所示，仅虎掌南星样本显示有明显的扩增曲线，Ct值在20个循环左右，而其他3个品种在40个循环以内均无明显扩增，将该扩增产物取出经琼脂糖凝胶电泳检测，电泳检测结果与荧光PCR结果一致：仅虎掌南星样本中有特异性的目的DNA条带产生，在其他样品中均没有特异性扩增条带产生（图3-B）。上述结果表示该方法具有良好的特异性。将该扩增产物制作成单克隆后送测序公司测序，测序结果显示该序列与Genbank中虎掌南星序列（AF469040.1）百分之百一致；表示该方法具有高度的准确性（图3-C）。

图3 特异性和准确性考察结果Fig.3 Specificity and accuracy studies

3.4 虎掌南星Real-time VPCR体系灵敏度考察

利用虎掌南星的引物和探针分别对质量浓度为0.1～1×104pg/μL的虎掌南星基因组DNA进行实时荧光VPCR扩增检测，荧光扩增曲线和标准曲线见图4。由试验结果可知（图4-A），当待检测模板浓度在0.1 pg/μL时，在荧光扩增曲线上就可以看到明显的扩增曲线，说明该体系可以检测到低至0.1 pg/μL的DNA模板。与此同时，从标准曲线中还可以看出（图4-B），当待检测模板质量浓度在0.1～10 ng/μL内，Ct值与DNA浓度的lg值之间的相关系数（R2）为0.999 6，表明二者之间存在良好的线性关系，说明该体系条件良好，适合实时荧光PCR的扩增分析。

图4 灵敏度研究Fig.4 Sensitivity analysis

3.5 真实样本检测结果

如前所述，由于虎掌南星常被当做半夏使用，本课题组尝试利用上述虎掌南星Real-time VPCR快速扩增体系对课题组所采购的“半夏”药材进行检测。首先利用“2.2”项中所述的DNA提取方法对所购7个批次共56个样本的DNA进行提取，并对所提取的DNA质量进行分析和控制；再利用Real-time VPCR扩增方法对上述DNA进行扩增和检测。检测结果显示，第1批次和第3批次共16个样本在虎掌南星的快速鉴别体系中产生了典型的扩增曲线，且Ct值均在20左右（图5-A、B），提示上述16个样本为虎掌南星而非半夏，扩增产物经测序进一步验证无误，确定为虎掌南星品种；其余40个样本无明显扩增曲线，通过DNA测序确定为半夏正品（图5-C）。因此，通过以上结果证明所建立的虎掌南星快速检测方法具有高度的准确性和实用性。

4 讨论

从药材图片可以看出，半夏药材大小不一，形态各异，由于栽培变种等原因，半夏与虎掌南星在形态学上的差异已经变得比较模糊，而从DNA分子水平可以有效的对药材的真伪进行准确的鉴定。中药材的真伪鉴定除了正品的鉴定，也包括伪品的识别，前期已有文献报道了半夏药材的真伪鉴定方法[20]，本实验报道了虎掌南星的快速鉴别法，二者联用可以互为补充，全面的实现半夏药材以及虎掌南星药材的质量评价。另一方面，中药的质量控制除了定性鉴别还包括定量分析，大量研究证明以DNA为基础的分子鉴定方法可以有效的应用于中药材的定性鉴别；在定量分析上，由于DNA含量受采收时间、药材储存时间等因素影响较大，利用药材DNA含量来对药材重质量进行定量分析的研究较少，但是根据本研究结果，如要实现定量分析，可以对一批药材采取抽样分析，如抽取一定量数目的单个药材，并对每一颗药材都进行鉴别，最后进行统计学计算，得出本批药材的定量分析结果。如要实现对大量样本的真伪鉴定，这就要求该检测方法能够快速、便捷、高通量地处理大量样本。

图5 样本照片和检测结果Fig.5 Sample photos and analysis results

Real-time PCR法由于其具有闭管、实时监测、可以有效降低污染等优点，目前在临床病原微生物的检测方面应用较为广泛，但在中药材的真伪鉴定领域报道较少，本实验在Real-time PCR法的基础上，建立了更加快速的Real-time VPCR检测方法，使得该技术的应用变得更加简单和快捷，目前实现了在24 min之内完成对虎掌南星特异性DNA的快速扩增和实时检测，避免了开盖检测和容易污染等问题，方法本身在高效快速的基础上还兼具有灵敏、特异和准确等优点，对7个批次56个盲测样本的准确鉴定也证明了方法的准确性和实用性。随着新型冠状病毒疫情的爆发，各类新型核酸检测仪器和核酸扩增技术迅速发展，推动着整个核酸检测技术朝着更高通量、更加快速的方向前进。核酸检测主要包括核酸提取、核酸扩增和扩增产物的检测3个步骤，本实验应用快速核酸扩增技术解决了虎掌南星药材核酸的快速扩增和扩增产物检测的问题，在今后的应用中，如果可以结合DNA自动提取工作站，就可以实现虎掌南星药材的自动化、高通量、快速检测，有效解决中药基因检测实际应用过程中的科学问题、推动中药基因检测技术在中药质量控制上的实际应用。同时，本实验所用的方法也可以推广到其他中药品种，为其他中药的质量评价提供新的选择和参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突