创制非天然辅酶偏好型甲醇脱氢酶

王俊婷，郭潇佳，李青，万里，赵宗保

（1 中国科学院大连化学物理研究所，辽宁 大连 116023；2 中国科学院大学，北京 100049）

甲醇是大宗有机一碳化合物，全球年产量达6000 万吨，有望成为未来生物炼制产业的重要原料［1-2］。煤、天然气、页岩气和CO2等通过化学法可规模化制备甲醇，而在废物处理和垃圾填埋场中，厌氧消化产生的甲烷和合成气，也可进一步转化为甲醇［3］。通过改造甲基营养型微生物或重建甲基利用途径，构建了一系列以甲醇为原料的微生物细胞工厂［4-5］。甲醇氧化酶将甲醇氧化为甲醛为代谢提供碳源，同时产生过氧化氢，后者需要消耗额外能量予以清除［6］。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，图1）依赖型甲醇脱氢酶（MDH）也可氧化甲醇合成甲醛，同时生成化学计量的NADH 可作为代谢的还原力［7］。来源于嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilusDSM2334 的NAD 依赖型MDH（BsMDH，UniProt：P42327.1）对甲醇亲和力较高［8］，Km为20 mmol/L［7］。目前文献中研究较多的NAD 依赖型MDH 包括BsMDH 和Bacillus methanolicus（BmMDH）［6］，而BmMDH对甲醇的Km为132 mmol/L［1，9］，其对甲醇的亲和力比BsMDH 更低。除此之外，还有来源于谷氨酸棒杆 菌Corynebacterium glutamicum的MDH 的Km也在97 mmol/L 左右；来源于钩虫贪铜菌Cupriavidus necatorN-1 的MDH 与BmMDH 相似，对甲醇的亲和力在132 mmol/L 左右，且对ACT 不敏感；来源于解木糖赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus xylanilyticus的MDH 的Km在3 mmol/L 左右，虽然对甲醇的亲和力相对较高，但其最适反应条件为pH9.5 和55 ℃，不符合大肠杆菌的最适生长条件［10］。研究表明，BsMDH 易于在大肠杆菌中过量表达，已成功用于构建利用甲醇的工程菌株［11-12］或基于甲醇的胞外氧化还原体系［13］。

图1 NAD及NCD的结构Fig.1 Structures of NAD and NCD

NAD 及其还原型NADH 是胞内重要的辅因子，广泛参与氧化还原代谢反应［14］。……