鸭坦布苏病毒纳米PCR方法的建立及应用

李得鑫,李佳暖,李富言

（1.山东畜牧兽医职业学院 261000；2.山东富言禽病研究院 261100）

鸭坦布苏病主要危害对象是蛋鸭，主要特点是蛋鸭产蛋下降[1]。目前快速诊断该病的方法有PCR、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR、RT-LAMP等方法。这些方法的优点很明显，检测快速，敏感性更高，但是荧光定量PCR所需的仪器很昂贵，LAMP对环境要求很严格，容易形成气溶胶。由于这些缺点，导致这些方法在临床应用时很受局限[2]。为了改善这种情况，本研究针对鸭坦布苏E基因，建立了一种快速、灵敏、特异的纳米PCR 检测技术。

1 材料

1.1 病原

实验室分离的鸭坦布苏病毒（DTMUV）、鸭病毒性肝炎（DHV）、鸭瘟（DPV）、鸭病毒性肠炎（DEV）毒株。

1.2 试剂

由全式金（北京生物科技有限公司）生产的Mark2K，Nano试剂盒。

2 方法

2.1 引物设计

以GeneBank：KC136210.1 E基因为模板，应用primer5软件设计扩增DTMUV的E基因的348bp目的片段的引物。引物由瑞普公司合成。

表1 引物信息

2.2 RNA的提取

250μL病毒与750uL Transzol混合，强烈振荡5min，静置5min；加250μL氯仿，剧烈振荡1min，静置5min，4℃，12000r/min, 15min离心；吸取上层液体600μL于EP管中，加等量异丙醇，混匀后，室温静置15min, 4℃, 12000r/min, 15min离心; 弃上清加900μL DEPC水酒精，4℃，12000r/min, 8min;弃上清，离心12000r/min, 3min; 利用移液枪枪吸取剩余上清液，超真空干燥；最后加上9.5μL溶解液。

反应条件优化 DTMUV最佳的纳米PCR反应体系为：2×Nano Buffer12.5μL，F1为0.5μL，R1为0.5μL，cDNA为1μL，ddH2O为10μL，Tap酶为0.5μL；最佳PCR反应条件为94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 21s, 30个循环；72℃5min。

敏感性的检测 模板浓度经检测为3.7ng/μL，为得到浓度梯度标准品，将模板用溶解液按10倍倍比稀释溶解，分别利用纳米PCR和普通PCR这两种方法对稀释后的模板进行扩增，比较二者的敏感性。

特异性的检测 利用设计的引物对DTMUV、DHV、DPV、DEV进行特异性检测。

3 结果

3.1 从电泳图1可以看出，DTMUV的348bp的目的片段被成功检出。……