基于网络药理学和分子对接探讨温阳通络方治疗类风湿关节炎的作用机制*

汪宗清 侯卫 聂红科 宋娜 王兴强 汤小虎, 彭江云,

(1.云南中医药大学第一附属医院,云南 昆明 650032;2.云南中医药大学,云南 昆明 650500)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)属于全身性、自身免疫性炎症性疾病，其基本病理表现为滑膜炎和血管翳的形成，并逐渐出现关节软骨和骨破坏，最终导致关节畸形和功能丧失，严重影响患者生存质量[1]。RA属于中医学“痹证”范畴[2]，《素问·痹论》言:“风寒湿三气杂至，合而为痹也。”吴生元教授认为“阳虚邪凑”为痹证的关键病机，常风寒湿三痹合治，以散寒为主要治法，温阳益肾、活血通络为辅，兼具祛邪通阳和补虚扶阳，两者相得益彰，并广泛应用于RA的临床诊治中。

吴生元教授为国家级名老中医、云南省已故名中医,著名扶阳学派代表人物吴佩衡的学术传人。温阳通络方(蠲痹颗粒)为吴生元教授在继承云南吴氏扶阳流派学术思想的基础上，结合多年治疗痹证的临床经验，以桂枝附子汤合麻黄附子细辛汤为基础，化裁拟定而成，全方由附子、桂枝、细辛、麻黄、羌活、独活、青风藤、透骨草、五加皮、赤芍、川芎、薏苡仁12味中药组成，具有温阳散寒，活血通络之功，现作为云南中医药大学第一附属医院有效院内制剂，在云南20余家医院广泛使用。多年的临床实践研究及动物实验研究表明，温阳通络方对RA具有良好的临床疗效及安全性[4-9]，但目前尚缺乏系统的研究。因此，基于前期临床及动物研究基础，本文运用网络药理学和分子对接的研究方法，以求更为全面了解温阳通络方的机制，为其更加深入的机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1数据库与软件 数据库和软件主要包括:TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、Uniport数据库(http://www.uniprot.org/)、STRING数据库(https://string-db.org/)、GO数据库(http://geneontology.org/)、KEGG数据库(https://www.kegg.jp/)、Venny(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)、RSCB数据库(http://www.rcsb.org/)、Cytoscape3.7.2软件、R3.6.2软件、Chem3D 18.0软件、AutoDock Tool 1.5.6软件、AutoDock Vina 1.1.2软件、pymol 3.7软件、LigPuls软件。

1.2温阳通络方的化学成分 通过TCMSP数据库检索温阳通络全方附子、桂枝、细辛、麻黄、羌活、独活、青风藤、透骨草、五加皮、赤芍、川芎、薏苡仁12味所有化学成分，删选条件为口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18、药物对小肠上皮细胞穿透性(Caco-2)≥-0.4[10]。在“Related Targets”栏目检索并筛选温阳通络方有效活性成分的作用靶点，最后将筛选得到的所有靶点均经Uniport数据库转化成蛋白质ID格式，以便于后续处理分析。

1.3RA相关靶点的获取及与温阳通络方靶点的映射 通过GeneCards数据库以“rheumatoid arthritis”作为检索词获取疾病相关靶点，筛选条件为Relevance score≥10，将温阳通络方靶基因与RA相关基因用R软件进行映射，筛选出共同靶基因，利用R软件制作韦恩图。

1.4活性成分-靶点网络构建 利用Cytoscape 3.7.2软件，将上述得到的活性成分、共同靶基因数据导入软件中，制作“活性成分-靶点网络图”，并计算其Degree值，筛选出核心成分。

1.5蛋白互相作用网络的构建与核心靶点的分析 将共同靶基因数据导入String数据库，物种选择为“Homo Sapience”进行PPI网络互作图，设置连接评分最小值为0.700，删除游离的节点，获得蛋白互作关系，导出TSV文件，导入Cytoscape 3.7.2软件中，计算各主要蛋白之间的互作次数，并据此找到核心靶点。

1.6基因本体(GO)功能富集京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 将共同靶基因转换成entrezID。然后在R软件安装“clusterProfiler”包，根据已转换的entrezID，以P<0.05进行关键靶基因的GO和KEGG功能富集分析，GO富集分析又包括生物过程(biological process，BP)、分子功能(molucular function，MF)和细胞组分(cellular component，CC)3个分支。结果以条形图和气泡图形式展示。

1.7分子对接验证 以温阳通络方主要活性成分以及传统治疗药物甲氨蝶呤、来氟米特、醋氯芬酸作为配体，以PPI网络中Degree>20的核心靶点作为受体。

配体准备：通过PubChem数据库下载排名前五的活性成分以及3个传统治疗RA药物的化学结构，保存为SDF文件，导入Chem3D 18.0软件，进行MM2力场进行构象优化，将其转换为mol2格式，利用AutoDock Tool 1.5.6软件对其进行加氢、加电荷处理，并保存为pdbqt格式。

受体准备：通过RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载排名前10的靶蛋白结构式的PDB格式文件，并利用Pymol软件除去靶蛋白中水分子及复合配体，以pdb格式保存，再通过AutoDock Tool 1.5.6软件对其包括加氢、加电荷等，并保存为pdbqt格式。

对接参数准备：通过AutoDock Tool 1.5.6软件中的“grid”设置网格大小和相应的位置以初步确定成分和靶蛋白相结合的位点。

对接：将准备好的蛋白文件、配体文件、化合物文件以及脚本放入相应文件夹，利用AutoDock Vina(v1.1.2)进行分子对接。

分析：选取结合能最低的最优结合模式利用PyMOL和LigPuls软件作图分析。

2 结果

2.1温阳通络方活性成分和潜在靶点 通过筛选条件，从TCMSP数据库中共获得温阳通络方119个活性成分。其中附子16个、桂枝7个、细辛8个、麻黄21个、羌活12个、独活8个、青风藤6个、透骨草3个、五加皮3个、赤芍20个、川芎6个、薏苡仁9个。整合TCMSP数据库预测，以及通过Uniprot数据库校正去重，共获得383个化合物相关潜在靶点。

2.2RA相关基因 在Genecards数据库中共找到4157个RA相关基因，评分排名前10的靶点分别是白细胞介素6(IL-6)、人类白细胞抗原组织相容复合物DRβ1(HLA-DRβ1)、肿瘤坏死因子(TNF)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22(PTPN22)、白介素2受体α(IL2Ra)、白细胞介素10(IL-10)、信号传导转录激活因子4(STAT4)、4型肽精氨酸转亚胺基酶(PADI4)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、白细胞介素1β(IL-1β)，根据Relevance score≥10进行筛选，共获得425个相关基因，与温阳通络方活性成分潜在靶点对比，共有57个共同基因，韦恩图(图1)，通过与温阳通络方的119个活性成分匹配后，得到52个具有治疗RA作用的活性成分。

图1 活性化合物-疾病交集基因韦恩图

2.3化合物-靶点网络网络的构建 将52个活性成分及57个交集靶点数据导入Cytoscape 3.7.2软件，构建成分靶点网络图，并删除与网络图连接不紧密的节点，结果见图2。图中黄色为药物与疾病共同基因，绿色表示温阳通络方中能与这些基因反应的有效成分，并对该网络图中的每个节点的Degree进行分析。Degree在活性成分节点表示该活性成分所对应的靶点个数，这意味着Degree值越大，在治疗RA的过程中所发挥的作用也越大。可得出前5位核心成分为槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、黄芩素(baicalein)、去氧乌头碱(deoxyaconitine)分别能与37、19、15、10、9个关键靶点连接，其中对治疗RA具有重要的意义，具体见表1，选取Degree≥3的活性成分进行展示。

图2 活性成分-作用靶点网络

表1 关键化合物的基本信息(Degree≥3)

续表1 关键化合物的基本信息(Degree≥3)

2.4核心靶点互作图 将57个共同靶基因导入String数据库中，删除游离的靶点5个，将蛋白互作文件导入Cytoscape 3.7.2软件获得蛋白互作图，见图3，图中圆形节点表示每个基因蛋白，颜色由深变浅、图案由大变小映射degree由大变小，由图可见白介素6(IL6)，白介素1β(IL1β)，CC趋化因子(CCL2)，前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAKP8)，血管内皮生长因子A(VEGFA)，丝氨酸蛋白激酶1(AKT1)，原癌基因(JUN)，丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)，细胞间黏附分子-1(ICAM1)，基质金属蛋白酶9((MMP9)，信号传导及转录激活因子1(STAT1)等基因排名靠前，这些度值较大的节点在整个网络中起着关键的作用，可能是温阳通络方治疗RA的关键靶点，其基本信息见表2。

图3 温阳通络方靶点蛋白互作网络

表2 PPI中的核心基因(degree≥10)

2.5GO功能富集分析与KEGG通路富集分析 使用R软件对57个共同靶点进行GO功能富集分析，其中生物学过程1399条，分子功能60条，细胞组成22条，在生物过程中对脂多糖的调节(response to lipopolysaccharide)、对细菌起源的分子的反应(response to molecule of bacterial origin)、金属离子反应(response to metal ion)、抗氧化反应(response to oxidative stress)等排名靠前；在细胞组分中胞膜窑(caveola)、质膜筏(plasma membrane raft)、细胞膜膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)、膜区(membrane region)、黏着斑(focal adhesion)、细胞基质黏着小带(cell-substrate adherens junction)和细胞-基质结(cell-substrate junction)比例最大；而在分子功能中与细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)和细胞因子活性(cytokine activity)关系最密切，具体结果见图4a/4b/4c。

图4a GO通路富集分析的BP分析气泡图(前20)

图4b GO通路富集分析的CC分析气泡图(前20)

图4c GO通路富集分析的MF分析气泡图(前20)

通过KEGG分析结果显示共有123条KEGG代谢通路参与其中，筛选出富集基因数较多的前20条通路，主要涉及AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、松弛素信号通路、美洲锥虫病、Th17细胞分化、类风湿关节炎等。通路上靶点基因越多，提示温阳通络方可能通过调控该信号通路从而起到治疗作用。涉及炎症反应、细胞凋亡与免疫调节等多个环节，提示温阳通络方通过调节多种代谢通路共同发挥治疗RA的作用。

图5 KEGG通路富集分析柱状图(前20)

2.6分子对接结果 将PPI网络中排名前10的靶点蛋白分别与甲氨蝶呤、来氟米特、醋氯芬酸和前5位活性成分进行分子对接验证，结果见表3。若结合能<0，表明配体分子均能和受体蛋白自发地结合，结合能<-5.0 kJ·mol-1，表明其结合性好，结合能越小对接越好[11]。表中所有活性成分均能与靶点蛋白较好地结合，且91.67%的活性成分结合性好于醋氯芬酸，85%的结合性好于来氟米特，30%的结合性好于甲氨蝶呤，虽然甲氨蝶呤与各关键靶点结合性能比温阳通络方核心成分好，但结果并无明显差距。通过对比发现，槲皮素与木犀草素与各靶点结合能大部分优于其他化合物，其中，luteolin与MMP9结合性(-10.7 kJ·mol-1)最好，通过pymol可视化分析可见，木犀草素与MMP9活性位点Gln227、Ala189、Leu188、Met247形成了4个较强的氢键相互作用，木犀草素上的苯环与HIS226残基形成了π-π堆积作用，这是促使其结合到活性位点的主要作用力，以及与周围其他残基的疏水作用进一步稳定了化合物与蛋白之间的结构，见图6。

表3 温阳通络方核心化合物以及临床治疗RA药物与关键靶点的结合亲和力

图6 A：木犀草素与MMP9分子对接三维图；B：木犀草素与MMP9分子对接二维图

3 讨论

温阳通络方具有温经散寒、祛风除湿、通络止痛之功，主治风寒湿痹型RA。《医宗必读·痹》云：“治痛痹者散寒为主，疏风燥湿，仍不可缺，大抵参以补火之剂，非大辛大温，不能释其凝寒之害也”。方中附子辛、甘、大热，温阳散寒除湿而止痹痛；桂枝、细辛、麻黄辛、温，祛风散寒，温经通络,并助附片温阳散寒之功；川芎辛温，活血通络止痛；赤芍性苦、微寒，入血分，有活血化瘀通络之效，透骨草、青风藤、五加皮、羌活、独活等药祛风除湿，止一身之痹痛，薏苡仁健脾渗湿除痹。该方治疗RA的临床疗效已被广泛认可，具有良好的抗炎作用、免疫抑制功效及良好的安全性，但具体机制不甚明确。有研究发现，其对RA的治疗作用可能通过干预Th17分化所需的关键细胞因子及转录因子的表达，抑制IL17A等促炎因子的分化而降低其高致病性，阻止CD4+T细胞向高致病性Th17细胞分化，同时通过减少IL6的表达，上调具有免疫抑制功能Treg细胞的表达等方面，从而阻止或延缓了RA的发展与转归[12-13]。以往的研究为本文提供了线索及基础，但尚不全面，随着系统生物学的推广，基于大数据的网络药理学已成为分析复杂成分的中药方剂作用机制的重要方法。

通过网络药理学研究发现，温阳通络方的活性成分119个化合物，可在体内作用于383个靶点，进一步分析发现，在排名靠前5的活性成分中，有4个均属于黄酮类化合物，包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、黄芩素，黄酮类化合物是最丰富的酚类，在抗黄嘌呤氧化酶活性、免疫调节[14]等方面均具有显著效果，槲皮素作为作用靶点(37个)最多的化合物，可显著抑制关节炎症反应，通过抑制NF-κB的生物活性，减少Th17分化及IL1β、IL17、TNF-α的蛋白表达，减轻氧化应激反应、抑制滑膜细胞的异常增殖与环氧合酶活性等，从而起到消炎镇痛、抑制骨损伤的效果[15-16]；木犀草素可下调TLR/MyD88/NF-κB信号通路，进而抑制下游炎症因子IL1β、IL6、TNF-α的表达[17]；黄芩素能抑制IL1β诱导的RAFLS增殖、NF-κB转录活性和MIF介导的信号传导[18]；而去氧乌头碱则具有显著的镇痛抗炎活性[19]，以上核心成分可能作为温阳通络方治疗RA的主要药效群。

通过对交集基因进行PPI互作分析发现，IL6、IL1β、CCL2、PTGS2、MAKP8、MAPK1、VEGFA、AKT1、JUN、ICAM1、MMP9等为关键基因。白介素家族是一类最庞大、最重要的细胞因子，在机体内免疫调节中发挥着重要的作用，大量研究表明炎症相关的细胞因子及趋化因子在RA的发病过程中发挥重要作用，IL6和IL1是RA病程中主要的炎症介质，其主要致病作用包括促进炎症相关的B细胞和Th17细胞的分化以及急性期蛋白的合成，通过多种过程驱动RA的病理生理进程[20]；MAPK基因参与的信号通路可减少氧自由基，抑制细胞增殖并促凋亡，减少炎症反应，同时减轻HIF-1α介导的血管生成，从而有效延缓RA进展[21]；有研究发现MMP-9表达蛋白水平与RA病情进展紧密关联，其能够较好反应病程进展程度，与RF、TNF-α、IL17具有显著相关性[22]；VEGF基因与KDR基因参与血管新生及NF-κB信号通路，调控滑膜细胞增殖凋亡，及血管翳形成[23]；在GO功能富集生物过程中，对脂多糖的调节、对细菌起源的分子的反应、抗氧化反应列前三位，细菌脂多糖作为革兰阴性菌的重要致病因子，能引起多种炎症反应。在温阳通络方治疗RA可能是作用于以上交集基因，从而抑制炎性反应、抗氧化反应等多种生物学功能来起到治疗效果。

在KEGG通路富集结果中，其通路包括AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、IL17信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、松弛素信号通路、美洲锥虫病、Th17细胞分化、类风湿关节炎等，其中Th17细胞分化，IL17信号通路为蠲痹颗粒治疗RA关键通路，与前期实验研究相互印证，AGE-RAGE信号通路通过引起氧化应激反应与激活NF-κB[24]，诱发一系列炎症级联反应，破坏髓鞘、细胞骨架等蛋白[25]，骨细胞能感应液体流动产生的剪切应力而产生破骨和成骨的信号，并通过树突将信号传递给骨表面的成骨细胞和破骨细胞，从而调节骨骼重建[26]，而流体剪切应力又间接导致动脉粥样硬化，使关节局部淤阻。肿瘤坏死因子作为一种关键的细胞因子，可以诱导广泛的细胞内信号通路，包括细胞凋亡、炎症和免疫，靶向TNF抑制剂(如英夫利昔单抗、阿达木单抗等)对RA的治疗良好的临床疗效也进一步验证了该因子及其通路在RA中的重要地位。

分子对接显示关键靶点与温阳通络汤中槲皮素、木犀草素、山柰酚、黄芩素、去氧乌头碱5种有效成分能稳定结合，且与传统治疗RA药物类风湿关节炎、来氟米特、醋氯芬酸结合能相当，这些有效成分有望成为治疗RA的潜在药物。

综上所述，本文运用网络药理学和分子对接的方法，初步探讨了温阳通络方治疗RA的潜在物质基础及可能的作用机制。结合前期的研究成果及分子对接结果，可以部分地验证本研究预测结果的正确性，也为进一步机制研究和扩大临床适应范围指出了较可靠的研究方向。但数据库中纳入的信息有一定的局限性，可能对研究结果有一定的影响。因此，温阳通络方对治疗RA的作用机制还需待进一步实验及临床验证。