枸杞枝条颗粒饲料对围产期肉牛抗体水平、细胞因子及激素分泌的影响

王建东，安 魏，王亚军，侯鹏霞，马秀明，于 洋，梁小军*

（1.宁夏农林科学院动物科学研究所，银川 750002；2.宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所，银川 750002；3.银川市西夏区三鑫绿源肉牛养殖专业合作社，银川 750021）

枸杞属于茄科灌木，具有很强的萌蘖能力，在生长期需要不断的抹芽、剪枝；在休眠期需要对树体进行整形修剪，形成丰产、稳产树形。形成的枝条可作为饲料原料进行利用，不但解决资源浪费，同时在生态环境的保护上也起到关键作用。枸杞枝条的饲用化主要是利用其所含的枸杞多糖以及黄酮。据研究，不同生长期、不同区域的修剪枝条所含枸杞多糖为2.21 %～5.70 %，总黄酮为0.24 %～0.57 %。本试验中枸杞枝条的添加是以“国家肉牛牦牛产业技术体系专项”课题组研发的饲料新产品“肉牛免疫增效功能性预混料”为参考，肉牛日粮添加枸杞多糖3g·d-1。本次测得枸杞枝条中枸杞多糖含量为4.5%，考虑到枝条中枸杞多糖利用效率等因素，选择在日粮中添加枸杞枝条0.975 kg·头-1·d-1[1]。本试验通过对比不同试验组围产期肉牛的抗体水平、细胞因子及激素等指标的差异，以期进一步了解日粮中添加枸杞枝条对围产期肉牛免疫指标的影响。

1 材 料

1.1 枸杞枝条颗粒饲料

枸杞枝条收集于宁夏枸杞产地，水分含量为10%～15%，采用刀片式粉碎机、锤式粉碎机进行两段粉碎法粉碎成小段（≤5cm），压成颗粒。测得其中多糖含量为4.5 %，水分含量为3.77 %，粗蛋白含量为18.4 %，粗灰分含量为10.0 %。

1.2 主要检测试剂盒

免疫指标测定：肉牛免疫球蛋白A（IgA）ELISA试剂盒（生产批号E20200514-77090A）、免疫球蛋白G（IgG）ELISA试剂盒（生产批号E20200518-77091A）、免疫球蛋白M（IgM）ELISA试剂盒（生产批号E20200520-77092A）、γ干扰素（IFN-γ）ELISA试剂盒（生产批号E20200520-77020A）、白细胞介素-2（IL-2）ELISA试剂盒（生产批号E20200519-77028A）、白细胞介素-4（IL-4）ELISA试剂盒（生产批号E20200521-77029A）、白细胞介素-8（IL-8）ELISA试剂盒（生产批号E20200519-77031A）、白细胞介素-13（IL-13）ELISA试剂盒（生产批号E20200520-77360A），均由上海科淘生物科技中心生产；人肿瘤坏死因子（TNF-α）放射免疫分析药盒（生产批号20200520），北京北方生物技术研究所生产。

激素指标测定：牛胰岛素样生长因子结合蛋白-2（IGFBP-2）ELISA试剂盒（生产批号GRE77235A）、牛胰岛素样生长因子结合蛋白4（IGFBP-4）（ELISA)试剂盒（生产批号GR-E77903A）、牛结合珠蛋白（HP）ELISA试剂盒（生产批号GRE77077A）、牛脱氧吡啶酚/脱氧吡啶啉（DPD）ELI⁃SA试剂盒（生产批号GR-E77128A）、牛骨碱性磷酸 酶（BALP）ELISA试剂盒（生产批号GRE77806A）、牛5羟色胺（5-HT）ELISA试剂盒（生产批号GR-E77625A）、牛酮体（KB）ELISA试剂盒（生产批号GR-E77812A），上海科淘生物科技中心生产；人胰岛素（INS）放射免疫分析药盒（生产批号20200520），北京北方生物技术研究所生产。

1.3 主要仪器

酶标仪（SM-3），北京天石天力公司产品；自动洗板机（ST360W），上海科华公司产品；电热恒温器（HH-W21-600），天津泰斯特有限公司产品；离心机（TDL80-2B），上海安亭科学仪器有限公司产品；γ-放射免疫计数仪（DFM-96），合肥众成机电技术开发有限责任公司。

2 方 法

2.1 试验设计

选择体况相近、胎次相同、怀孕时间相同的围产期肉牛60头，分为2组，对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮的基础上添加0.975 kg·头-1·d-1的枸杞枝条颗粒饲料，其他营养管理均相同，饲喂42d，分娩后第42天进行采血，利用定量检测卡检测免疫球蛋白、细胞因子和激素水平。

2.2 血样采集

试验前、后各组牛尾静脉采血0.5 mL，室温放置1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，然后于2000r·min-1离心10min，收集血清备用。

2.3 外周血液各种免疫因子和相关激素含量的检测

采集试验前后的血清，测定肉牛IgA、IgG、IgM、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-8、IL-13和IGFBP-2、IGFBP-4、HP、DPD、BALP、5-HT、KB含量，严格按照ELISA试剂盒说明书步骤操作检测；TNF-α和INS严格按照放射免疫分析药盒说明书操作。

2.4 数据统计分析

利用SPSS20对所获数据进行处理分析，同时采用χ2检验方法及t检验方法进行显著性分析。

3 结果与分析

3.1 枸杞枝条颗粒饲料对围产期肉牛免疫球蛋白、细胞因子水平的影响

测定围产期母牛的免疫球蛋白水平、细胞因子水平，结果见表1。

表1 围产期前后试验母牛血液免疫球蛋白、细胞因子水平

由表1可见，添加枸杞枝条颗粒饲料的试验组围产期母牛IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-4水平比对照组有所增加，其中IgA、IgG、IgM水平两组间差异极显著（P＜0.01），IL-4、IL-8、IL-13、TNF-α水平两组间差异显著（P＜0.05），IL-2、IFN-γ水平两组间差异不显著（P＞0.05），但均有所增加。

3.2 枸杞枝条颗粒饲料对围产期肉牛激素、代谢产物水平的影响

测定的围产期母牛激素水平，结果见表2。

表2 围产期前后试验母牛激素水平

由表2可知，添加枸杞枝条颗粒饲料的试验组围产期母牛INS、IGFBP-2、IGFBP-4、HP、DPD/BALP、5-HT比对照组有所升高，KB有所下降，但差异均不显著（P＞0.05）。

4 讨 论

4.1 枸杞枝条颗粒饲料对围产期肉牛免疫于球蛋的影响

IgG、IgA、IgM是肉牛体内重要的免疫球蛋白，其含量的上升预示着体液免疫启动。植物多糖可以诱导动物机体产生免疫球蛋白，继而增强机体免疫功能。马吉锋等[2]研究表明，育肥架子牛日粮中添加枸杞多糖类饲料预混剂，饲喂14d时血液中免疫球蛋白含量极显著的高于0d时，说明添加枸杞多糖可提高肉牛的体液免疫能力。本试验围产期母牛IgA、IgG、IgM含量有所增加，且与未饲喂枸杞枝条颗粒饲料母牛差异极显著（P＜0.01），表明在围产期母牛日粮中添加枸杞枝条颗粒饲料0.975 kg·头-1·d-1，可以有效提高体液免疫水平。

4.2 枸杞枝条颗粒饲料对围产期肉牛细胞因子的影响

IL-2的免疫治疗已经应用多年，IL-2具有辅助T细胞分化的作用，并分泌细胞因子IFN-γ，IL-2除了辅助T细胞外，还可以促进静息状态的CD8+T细胞向记忆即效应T细胞的分化，说明IL-2有利于免疫记忆反应的形成[3]；IL-4的作用是促进Th2的分化，分泌细胞因子IL-4、IL-13。体外试验发现，IL-4是一种具有多种生物学效应的细胞因子，如对于B细胞、T细胞、肥大细胞、巨噬细胞和造血细胞都有免疫作用，可以增强IgG、IgE水平[4]；IL-8具有趋化和激活中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞的作用，对于急、慢性炎症、自身免疫性疾病等有重要作用；IL-13作为免疫调节细胞因子，可调节B细胞和单核细胞功能[5]；TNFα具有双重生物学效应，较低浓度时主要作为白细胞和内皮细胞的自分泌及旁分泌的调节物，参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染，促进组织修复及调节炎症反应，引起肿瘤细胞凋亡；IFN-γ具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和抗寄生虫的作用[6]。马吉锋等[2]研究表明，育肥架子牛日粮中添加枸杞多糖类饲料预混剂，饲喂肉牛免疫增效剂7d，即可促进肉牛细胞因子的分泌。本试验围产期母牛IL-2、IL-4、IL-8、IL-13、TNF-α、IFN-γ水平在试验后有所增加，其中IL-4、IL-8、IL-13、TNF-α水平显著增加（P＜0.05），表明在围产期添加枸杞枝条颗粒饲料0.975 kg·头-1·d-1，可以有效提高细胞免疫水平。

4.3 枸杞枝条颗粒饲料对围产期肉牛激素水平的影响

激素和代谢物在大脑中起着饱腹信号的作用，在控制采食量中起着重要的作用。这些信号可以通过血流或脑脊液（CSF）到达下丘脑和脑干这两个主要的纤维连接蛋白（FI）调节中心。近年来研究表明，胰岛素样生长因子（IGF）可能控制FI。IGF结合蛋白（IGFBP）是否在围产期受到调节，并对限食作出反应，因此也可能影响FI。INS、IGF-2、IGF-4浓度是评价牛能量平衡状况的三个指标[7]。通过INS、IGFBP-2或IGFBP-4的浓度可以评价哺乳初期的能量负平衡（NEB）；分娩前结合珠蛋白（HP）是产后母牛动员脂肪的预兆，本试验围产期母牛INS、IGFBP-2、IGFBP-4、HP试验后有所升高，但差异不显著P＞0.05，且处于正常范围，表明在围产期添加枸杞枝条颗粒饲料0.975 kg·头·d-1，可以有效改善围产期能量水平。

4.4 枸杞枝条颗粒饲料对围产期肉牛相关代谢水平的影响

牛围产期低血钙症用DPD/BALP值来评估。在哺乳期，5-HT与钙离子代谢、葡萄糖稳态有关。产后第1天血浆中5-HT的浓度可以作为围产期代谢紊乱及相关疾病的指示器，血清中5-HT与钙离子浓度、甲状旁腺激素相关蛋白水平正相关；血清中5-HT与产褥热发病率负相关（r＜-0.33）。5-HT浓度增加将减少产褥热的发病率。酮体KB监测可作为母牛酮病的诊断依据[8]。本试验围产期母牛DPD/BALP、5-HT、KB试验后有所升高，差异不显著（P＞0.05），且处于正常范围，表明在围产期添加该颗粒饲料0.975 kg·头-1·d-1，可以降低相应的疾病症状发生。

5 结论

枸杞枝条含有一定量的枸杞多糖，枸杞多糖是其发挥功效的主要物质，饲喂枸杞枝条颗粒饲料0.975 kg·头-1·d-1，饲喂42d后，可诱导机体产生免疫球蛋白、细胞因子等，提高围产期肉牛机体免疫力。枸杞枝条作为一种新型、高效、绿色、多功能的饲料添加剂应用于肉牛生产中，有着良好的应用前景。