免疫学检测联合痰涂片和痰培养检测在活动性肺结核临床诊断中的价值

田丽丽 杨新宇 代小伟 陈双双 赵琰枫 王嫩寒 张洁 易俊莉 任怡宣 陈昊 樊瑞芳 石伟先 武文清 黄春 丁北川

结核病主要通过呼吸道飞沫传播，因此需要快速、简便、准确的实验室诊断方法指导临床早期诊断，尤其是活动性肺结核的早期诊治[1]。病原学检查是诊断活动性肺结核的金标准，但有许多不足之处，不能满足临床需求，尤其是近年来菌阴肺结核患者比例显著增加[2]，给结核病诊治带来更大困难[3-6]。随着检测手段的发展，结核抗体检测、结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)等快速检测技术逐渐应用于临床，尤其T-SPOT.TB对诊断结核分枝杆菌感染有较高的敏感度和特异度，已成为诊断结核病的重要辅助手段[1]，对菌阴肺结核的诊断也提供了很大帮助。本研究回顾性分析了2014年1月至2019年12月北京结核病控制研究所收治的715例疑似肺结核门诊患者的资料，所有患者均行T-SPOT.TB、结核抗体、痰涂片、痰培养检测，以临床诊断结果为标准，分析4种方法单独及联合检测活动性肺结核的临床意义。

资料和方法

一、 一般资料

回顾性分析2014年1月至2019年12月北京结核病控制研究所门诊收治的715例疑似肺结核患者，入院时均行T-SPOT.TB、结核抗体、痰涂片、痰培养检测。以临床诊断和实验室诊断为标准[2，7]，明确诊断为活动性肺结核患者412例，为肺结核组；非结核病患者303例(其中经PCR确定为非结核分枝杆菌感染10例，肺部阴影待查268例，尘肺1例，肺炎8例，肺癌2例，慢性咽炎14例)，为非结核组。412例肺结核患者中，菌阳肺结核194例，菌阴肺结核218例；男性240例，女性172例；年龄13～95岁，中位年龄30(24，47)岁。所有患者均排除人类免疫缺陷病毒感染者。

二、检测方法

1.T-SPOT.TB检测：采用T-SPOT.TB(Oxford Immunotec公司，英国)试剂盒，从外周静脉血中分离出单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，在每个预包被抗γ-干扰素抗体的孔中加入2.5×105个PBMC，分别与早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)共同孵育16～20 h，使用酶联免疫斑点(ELISPOT)读板仪对斑点进行计数。阳性判定标准：(1)如果空白对照孔斑点数<6个，检测孔斑点数减去空白对照孔斑点数>6；(2)如果空白对照孔斑点数≥6个，检测孔斑点数必须>2倍的空白对照孔斑点数。反之，为阴性结果。阴性或阳性对照异常，试验均视为无效[8]。

2.结核抗体检测：结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒(胶体金法)(MP Diagnostics ASSURE®TB Rapid Test)购自MP生物医学亚太私人有限公司(MP Biomedicals Asia Pacific)。取患者血清25 μl至检测孔内，加3滴缓冲液于椭圆孔，直至样本前沿到达蓝色指示线即刻拉下分离片，加1滴缓冲液于加样孔，水平放置，15 min内判读结果。结果判读标准：(1)如果在测试线处(T)和质控线处(C)出现紫红色条带，则结核分枝杆菌抗体为阳性，任何深度条带均应判作阳性；(2)如果视窗内仅质控线处(C)显示紫红色条带，则结核分枝杆菌抗体阴性；(3)如果质控线处(C)条带未显示，则结果无效。

3.痰涂片、痰培养：萋-尼抗酸染色液、酸性罗氏培养基由珠海贝索生物技术有限公司提供。痰涂片抗酸染色镜检采用萋-尼染色，按照《结核病实验室检验规程》[9](简称《规程》)进行抗酸杆菌痰涂片镜检；分枝杆菌固体培养采用简单法，按照《规程》进行分枝杆菌分离培养检查。

三、质量控制

T-SPOT.TB检测试剂盒按照试剂盒内提供的阳性对照和阴性对照，与样品同时检测，确保实验结果的准确性；结核抗体检测根据检测反应板质控线条带显示判断，严格按照试剂盒检测规程以保证检测准确性；痰涂片与痰培养质量控制按照《规程》要求，进行抗酸杆菌痰涂片镜检及分枝杆菌培养的室内质量控制及室间质量评价。

四、统计学处理

采用SPSS 17.0软件对数据进行处理。计数资料采用“百分率(%)”描述，组间差异的比较采用卡方检验；两变量间相关性以Spearman 法进行相关分析。采用诊断性试验比较T-SPOT.TB检测与其他方法对活动性肺结核的诊断价值，绘制受试者工作特征曲线(ROC)，计算ROC下面积(AUC)。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、4种检测方法在肺结核组与非结核组中阳性检出率的比较

412例肺结核患者中，T-SPOT.TB检测阳性345例，阳性检出率为83.7%；303例非结核组患者中， T-SPOT.TB检测阳性63例，阳性检出率为20.8%，差异有统计学意义(χ2=2.823，P=0.000)。肺结核组结核抗体检测阳性184例，阳性检出率为44.7%；非结核组结核抗体检测阳性90例，阳性检出率为29.7%，差异有统计学意义(χ2=16.526，P=0.000)。活动性肺结核患者痰涂片检测阳性81例，阳性检出率为19.7%；非结核组痰涂片检测阳性3例，阳性检出率为1.0%；差异有统计学意义(χ2=56.912，P=0.000)。活动性肺结核患者痰培养阳性191例，阳性率为46.4%；非结核组痰培养阳性10例，阳性率为3.3%，差异有统计学意义(χ2=1.602，P=0.000)。

二、4种方法对活动性肺结核的检测效能

T-SPOT.TB检测活动性肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度分别为83.7%、79.2%、84.6%、78.2%、81.8%；结核抗体检测活动性肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为44.7%、70.3%、67.2%、48.3%、55.5%；痰涂片检测活动性肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为19.7%、99.0%、96.4%、47.5%、53.3%；痰培养检测活动性肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为46.4%、96.7%、95.0%、57.0%、67.7%。见表1。

表1 以临床诊断为标准4种检测方法对活动性肺结核的检测效能

三、联合检测对活动性肺结核的检测效能

T-SPOT.TB检测联合结核抗体、痰涂片及痰培养检测的敏感度为93.7%，均高于4者单项检测、2项(T-SPOT.TB+痰涂片、T-SPOT.TB+痰培养、痰涂片+痰培养、T-SPOT.TB+结核抗体、痰涂片+结核抗体、痰培养+结核抗体)联合检测和3项(T-SPOT.TB+痰涂片+痰培养)联合检测；4种方法联合检测阴性预测值最高，为85.6%。见表2。

表2 以临床诊断为标准4种方法联合检测对活动性肺结核的检测效能

四、4种检测方法分别检测及联合检测的AUC

T-SPOT.TB的AUC为0.815，结核抗体检测的AUC为0.575，痰涂片的AUC为0.593，痰培养的AUC为0.715，四项联合检测的AUC为0.894。见图1。

图1 4种方法单独及联合检测受试者工作特征曲线

续表1

讨 论

结核病早期诊治对于控制结核病病情及其传播具有重要意义[4]。目前，T-SPOT.TB、结核抗体检测联合痰涂片、痰培养检测为筛选活动性肺结核的常用且较有效的方法，其中，T-SPOT.TB为近些年发展起来的快速诊断结核病新技术，抗原ESAT-6和CFP-10为结核分枝杆菌特有的片段，因此能较好排除卡介苗接种、非结核分枝杆菌感染[10]。与痰涂片、痰培养、结核抗体检测相比，T-SPOT.TB 检测活动性肺结核具有更高的敏感度、特异度、准确度[11-13]。

国外γ-干扰素释放试验(IGRA)主要用于诊断结核分枝杆菌潜伏感染、监测结核分枝杆菌潜伏感染发展为活动性结核病[14]，而我国IGRA试验主要用于活动性结核病的辅助诊断和鉴别。有报道细菌学方法检测活动性肺结核的敏感度为49.75%，结核抗体检测总体敏感度为56.6%，联合检测后敏感度为83.1%[15]。本研究显示，痰涂片与痰培养联合检测活动性肺结核的敏感度为48.3%，结核抗体检测总体敏感度为44.7%，四种方法联合检测的敏感度为93.7%；T-SPOT.TB 检测活动性肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度分别为83.7%、79.2%、84.6%、78.2%、81.8%，略低于施瑞洁等[16]的报道；而痰涂片、结核抗体检测活动性肺结核的敏感度略高于陈晶等[4]的研究，可能与所选患者例数及痰液性状等因素有关。本研究显示，4种检测方法均对活动性肺结核有一定的诊断价值，其中T-SPOT.TB诊断活动性肺结核的效能最好。

本研究显示，T-SPOT.TB检测联合结核抗体及传统痰涂片、痰培养检测效能最高，诊断敏感度为93.7%，特异度为50.8%，AUC为0.894。略高于陈晶等[4]报道的6种检测方法联合检测的AUC(0.848)，说明T-SPOT.TB、结核抗体、痰涂片、痰培养联合检测对活动性肺结核有较高的诊断价值。T-SPOT.TB检测有较高的敏感度，但单纯采用T-SPOT.TB检测的特异度评价也有一定局限性，本研究T-SPOT.TB检测的特异度为79.2%，李曙光等[17]报道的肺癌患者T-SPOT.TB阳性率较高，可能因为肿瘤患者免疫力低下，易并发结核分枝杆菌潜伏感染等，此外，我国为结核感染高发国家，这些原因均可能导致T-SPOT.TB特异度较低，因此需要联合检测来提高诊断效能。

血清结核抗体检测有操作简单、检测快速等优点，在结核病临床辅助诊断应用较广泛，但其溶血样本和高脂血样本可能受免疫功能影响，在疾病急性感染早期即出现阴性结果，因而结核抗体检测活动性肺结核的敏感度、特异度不高，限制了疾病诊断与有效治疗[12]。本研究结核抗体检测的敏感度、特异度较国内外一些研究偏低[18-20]，可能主要是因为在试剂中抗原的选择及优化上有区别。敏感度、特异度与黄德东等[21]研究结果相差不大。痰涂片、痰培养对活动性肺结核诊断的敏感度较低，尤其是痰涂片，敏感度为19.7%，痰培养为46.4%。代小伟等[22]研究显示，痰涂片、痰培养的敏感度分别为22.5%、32.2%，可能与所选病例数、痰液性状等因素有关。另外，杨新宇等[23]的研究结果显示，无论是痰涂片或痰培养结果，合格痰标本的阳性检出率及量化分级指标均远远高于不合格标本。

将T-SPOT.TB、结核抗体、痰涂片、痰培养联合检测用于活动性肺结核的诊断，可起到互补作用，其中T-SPOT.TB避免了接种过卡介苗可能存在的抗原交叉反应，有较高特异度，结合结核抗体检测后从体液免疫与细胞免疫方面进行检测，再联合传统的痰涂片与痰培养检测，对提高诊断准确率有互补作用。

综上所述，T-SPOT.TB、结核抗体联合痰涂片、痰培养检测在活动性肺结核诊断中有较高的临床意义，可提高诊断敏感度、特异度、准确度。

本研究的不足之处是未将结核分枝杆菌核酸检测技术纳入评价体系。随着结核分枝杆菌核酸检测技术的普及应用，笔者建议今后可以系统评估结核分枝杆菌核酸检测技术及免疫学检查方法联合应用，对诊断活动性肺结核，尤其是病原学阴性肺结核的价值及成本，提出适合不同情况的最优诊断流程。