赶黄草调控Wnt4抑制TGF-β诱导肺纤维化相关基因表达的研究*

熊安英，牛 斌，张 雷，熊 瑛，宋 琦，何 翔，李国平△

(1.国家呼吸系统疾病临床研究中心成都市第三人民医院分中心/成都市呼吸健康研究所过敏与精准医学实验室，成都610031；2.四川省友谊医院呼吸与危重症医学科，成都 610011；3.西南医科大学附属医院胸外科，四川泸州 646000)

特发性肺纤维化是最常见的间质性肺病，具有侵袭性和致死性，5年生存率仅为20%[1-2]。该病好发于中老年男性，主要表现为干咳、进行性加重的呼吸困难，伴限制性通气功能障碍和气体交换障碍，导致低氧血症，患者最终因呼吸衰竭而死亡[3-4]。上皮细胞和内皮细胞通过分泌细胞因子和生长因子，如转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、血小板源性生长因子等，诱发肺纤维化的发生[5]。研究表明，TGF-β和Wnt信号通路在肺、肝、消化道等不同器官和系统的组织修复和重塑中发挥了重要作用[6]。多项研究也表明纤维化性肺疾病中TGF-β水平持续升高，可导致过度修复过程和器官功能障碍[7-8]，这为治疗特发性肺纤维化增加了困难。目前，延缓特发性肺纤维化进程的药物主要以吡非尼酮和尼达尼布为主，不良反应大且价格相当昂贵，给患者造成了一定的经济负担。因此，寻找一种安全有效且价格低廉的药物在肺纤维化的防治过程中极为重要。

赶黄草又名扯根菜，是我国分布广泛的一种天然草本植物。研究发现，赶黄草提取物对乙型肝炎、丙型肝炎、肝癌具有保护作用[9]，同时对乙醇或氧化性导致的肝损伤具有保护作用[10]。ZHOU等[11]发现赶黄草提取物生松素能通过SIRT3-TGF-β-smad信号通路抑制肝星状细胞的激活进而抑制肝纤维化。目前尚未发现赶黄草治疗肺纤维化的相关研究，在本课题组实验中，通过生物信息学分析发现TGF-β和Wnt4存在相互关系，因此，推测赶黄草可能通过抑制TGF-β和Wnt4相关信号抑制肺纤维化。本研究探讨赶黄草对肺纤维化的作用及其机制，以期对赶黄草的研究和临床应用提供理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

MRC-5人胚肺成纤维细胞(上海中乔新舟生物科技有限公司)；赶黄草对照品(成都瑞芬思生物科技有限公司，DZYC-G-028)；RNA simple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒、RNA SuperMix试剂盒和SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒(中国Vazyme公司)；最低基本培养基(minimum Eagle′s medium,MEM)、胎牛血清、Sodium pyruvate(美国Gibco公司)；MEM Nonessential Amino Acid Solution、丙酮酸钠、CCK8(中国Solarbio公司)；TGF-β、Wnt4(美国Abcam公司)；纤连蛋白(fibronectin,FN1)、Ⅰ型胶原(中国Bioss公司)；CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)；超净工作台(新加坡ESCO公司)；荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；激光共扫描显微镜(德国Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1数据收集

从基因表达数据库GEO(Gene Exppression Omnibus)中搜索TGF-β组(6个生物重复组)和对照组(5个生物重复组)相关转录组学的差异基因RNAs。

1.2.2数据预处理和RNAs的重注释

利用R软件的affy包进行数据预处理，对RNAs进行重注释。使用Agilent GeneSpring GXv12.1软件进行芯片数据均一化处理和差异分析，经过折叠倍率(fold change，FC)筛选出所有差异表达的RNAs，|lofFC|≥0.3，P<0.05。

1.2.3Wnt信号通路的功能富集和通路分析

使用富集分析工具对Wnt信号通路进行基因本体论(gene ontology，GO)分析，描述该信号通路中基因的表达趋势；同时将Wnt信号途径的调节进行GO和REACTOME富集分析比较，进一步阐述TGF-β因子与Wnt信号通路的相互关系。

1.2.4实时荧光定量PCR和激光共聚焦验证

(1)为了验证TGF-β和Wnt4之间的相互关系，设立空白组、TGF-β组(5 ng/mL)及Wnt4组(250 ng/mL)，作用24 h后收集细胞提取总RNA，逆转录后对FN1、平滑肌肌动蛋白A2(smooth muscle actin A2，ACTA2)、Wnt4进行实时荧光定量PCR实验。(2)为了探讨赶黄草是否通过Wnt4影响TGF-β介导的肺纤维化，对MRC-5细胞进行了赶黄草的毒性实验。将实验细胞分为空白组、TGF-β组、赶黄草+TGF-β组，在MRC-5细胞中加入TGF-β处理6 h后加入赶黄草(50 μg/mL)，培养24 h后，激光共聚焦检测FN1和Ⅰ型胶原蛋白α1链(COL1A1)蛋白荧光定量情况，同时收集细胞和提取总RNA，逆转录后进行实时荧光定量PCR实验。目的基因包括FN1、ACTA2、Wnt4蛋白的表达，见表1。

表1 基因实时荧光定量PCR引物序列

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 TGF-β组和对照组中差异表达基因

GEO数据库中共获得差异表达基因12 548个，在这些差异基因中有2 151个基因在TGF-β组低表达，有1 505个基因在TGF-β组高表达，其中Wnt4、ACTA2、COL1A1就属于高表达基因，见图1。利用聚类分析找出具有相同生物学过程或相似功能且差异比较明显的基因100个，选取在TGF-β组表达升高和降低的基因各50个，结果表明TGF-β组与对照组MRC-5细胞标本的生物学过程与功能区分比较明显；TGF-β组Wnt信号途径中Wnt4、ACTA2、COL1A1、FN1表达水平升高，其中Wnt4、ACTA2、COL1A1表达水平升高差异有统计学意义(P<0.05)，而FN1表达水平升高不明显，见图2。

红点：表达水平升高基因；蓝点：表达水平降低基因；黄点：表达无明显差异基因；|lofFC|≥0.5，P<0.05。

A：TGF-β组和对照组中100个差异明显基因热图(FC>2.0,P<0.05)；B：Wnt信号途径中相关基因热图。

2.2 Wnt信号通路中基因富集分析

通过GO富集图形分析，发现Wnt信号通路途径的调节基因与典型的Wnt信号通路中基因是一致的，且图形中ES值前的领头亚集形状中功能基因集在TGF-β组具有更明显的生物学意义。TGF-β组对不同数据库的Wnt信号通路的富集分析发现，TGF-β与Wnt信号通路的激活呈正相关，见图3。

A：典型Wnt信号通路差异基因的GO富集分析；B：调节Wnt信号途径的差异基因的GO富集分析；C：Wnt调节的信号通路差异基因的Reactome富集分析；D：Wnt信号通路中差异基因的KEGG分析。

2.3 TGF-β和Wnt4相互关系影响

为验证以上生物信息学分析的可靠性，在MRC-5细胞中加入TGF-β，发现FN1 mRNA表达水平明显升高(P<0.05)，同时Wnt信号通路中Wnt4基因mRNA表达水平也升高(P<0.05)；为了进一步说明TGF-β诱导肺纤维化是通过调控Wnt4，在MRC-5细胞中加入Wnt信号通路中的Wnt4进行处理，发现纤维化相关蛋白FN1 mRNA表达水平升高(P<0.05)，见图4。

A：TGF-β处理后FN1 mRNA表达水平；B：TGF-β处理后Wnt4 mRNA表达水平；C：Wnt4处理后FN1 mRNA表达水平。

2.4 赶黄草调控Wnt4抑制TGF-β诱导的肺纤维化

为验证赶黄草对MRC-5细胞的毒性，加入了不同浓度的赶黄草进行CCK8毒性实验，结果发现当赶黄草的浓度达到50 μg/mL时，MRC-5细胞培养24 h后没有明显的细胞毒性。在MRC-5细胞中加入TGF-β处理后与空白组比较，其FN1、ACTA2、Wnt4 mRNA水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；在TGF-β组加入赶黄草后，其FN1、ACTA2、Wnt4 mRNA水平较TGF-β组明显降低(P<0.05)；同时通过激光共聚焦检测各组MRC-5细胞中不同处理后的COL1A1和FN1蛋白荧光定量，其结果与实时荧光定量PCR结果一致，空白组COL1A1和FN1表达水平与TGF-β组比较明显降低，赶黄草+TGF-β组与TGF-β组比较，其纤维化蛋白COL1A1和FN1的水平也明显降低(P<0.05)，见图5。

A：不同浓度的赶黄草对MRC-5细胞的活力影响；B：实时荧光定量PCR检测赶黄草对MRC-5细胞中TGF-β诱导的Wnt信号通路的影响；C：共聚焦显微镜观察赶黄草处理MRC-5细胞后Wnt信号通路中COL1A1和FN1的荧光强度；D：定量分析COL1A1和FN1荧光强度；a:P<0.05，与0 μg/mL赶黄草比较。

3 讨 论

特发性肺纤维化是一种由异常的创伤愈合进程导致的疾病，其中上皮细胞损伤启动炎性因子，导致炎性细胞浸润、成纤维细胞异常增殖和胶原蛋白沉积[12-14]。TGF-β是一种对细胞分化增殖和炎性反应具有综合调节作用的多功能细胞因子[7]，在组织纤维化信号的启动中发挥着重要作用[15]。此外，TGF-β诱导上皮-间质转化和内皮-间质转化，同时肺内的肺泡上皮或内皮细胞向迁移性成纤维细胞转化[16]。Wnt信号通路是一组由蛋白质组成的信号转导通路，通过细胞表面受体将信号从细胞外传递到细胞内[17]。最近的研究表明，Wnt信号通路的成分已成为靶器官抑制纤维化的潜在靶点[18]。Wnt4是Wnt蛋白家族中的一员，作为局部作用的信号分子，调节细胞间的相互作用、增殖和迁移[19]。对成人子宫Wnt4的表达进行分析，发现Wnt4可参与调节子宫内膜基质细胞的增殖、存活和分化[20]。Wnt4/β-catenin信号通路已经证实可参与肝纤维化[21]、肺纤维化[22]的发生、发展。LAM等[23]报道Lrp5缺失小鼠由于废除了Wnt/β-catenin信号通路，对博莱霉素诱导的肺纤维化具有保护作用。本研究对GEO数据库的微阵列数据集进行GO和Wnt信号通路富集分析，发现TGF-β是调节Wnt信号途径的一个重要因素，随着TGF-β的加入Wnt信号途径即被激活，这与SPANJER等[24]发现Wnt受体能介导TGF-β诱导的促纤维化信号通路是一致的。但Wnt信号通路中配体、受体和共受体怎样参与TGF-β诱导的肺纤维化的调控尚不清楚。因此，了解Wnt调节的纤维化的潜在机制对于器官纤维化、钙化和异常血管重构等的有效治疗是必不可少的。

近年来随着临床辅助检查水平的不断提高，越来越多的特发性肺纤维化患者在早期病程中被及时发现，但目前该病尚无较好的治疗手段，且治疗的同时不良反应较大。中药在治疗特发性肺纤维化上具有独特的优势，目前多项研究已经证实中药能改善特发性肺纤维化患者症状、肺功能，提高患者生活质量，增加患者动脉血氧分压[25]。其中赶黄草作为一种天然草本植物，价格较低廉，研究发现赶黄草的提取物对乙醇或氧化性肝损伤具有保护作用[10]。从该植物中已鉴定出30多个具有抗氧化、抗癌和降血糖作用的化合物[9]。赶黄草中的生松素是中草药中常见的一种类黄酮，在不同细胞系中已被报道具有抗肝硬化和抗纤维化成分[26]，且对肝纤维化有治疗作用[11]。在用过氧化叔丁基诱导L02细胞氧化损伤模型中，赶黄草中的水提物显示出了对肝脏的保护作用[27]。为了进一步研究赶黄草对肺纤维化的潜在机制，本研究在MRC-5细胞中加入TGF-β后，FN1、ACTA2表达基因上调明显，说明TGF-β诱导的肺纤维化细胞模型成功，同时Wnt信号通路中的Wnt4基因表达也明显升高，说明TGF-β能诱导Wnt4的表达。同时在MRC-5细胞中加入Wnt4后，纤维化相关的FN1表达水平也升高，说明Wnt4能调控纤维化，这与Wnt4/β-catenin信号通路可介导肺纤维化的发生、发展是一致的[22]。当加入赶黄草后发现Wnt4表达明显降低，同时纤维化相关基因FN1、ACTA2、COL1A1的表达水平也明显下降，说明赶黄草对TGF-β诱导的肺纤维化具有保护作用，且可能是通过调控Wnt4实现的，这与LAM等[28]发现抑制Wnt信号通路可以有效抑制小鼠肺纤维化的发生、发展一致。在高侵袭性鳞状细胞癌细胞研究中，Wnt4还参与癌细胞晚期发生过程中细胞黏附，细胞运动和与上皮细胞向间充质细胞转变相关的侵袭[29]。SPANJER等[24]发现沉默FZD8能使TGF-β诱导的纤维化的Ⅰ型胶原、FN1、多能蛋白聚糖、ACTA2和结缔组织生长因子表达水平降低，同时沉默FZD7可抑制TGF-β1诱导的肺纤维化，且能够通过典型或非典型的Wnt信号通路进行信号转导参与组织纤维化的调节[30]。结合上述研究结果，赶黄草可能通过抑制Wnt信号通路中的Wnt4基因来达到抗纤维化的目的。

综上所述，赶黄草能降低TGF-β诱导的肺纤维化，可能是通过调控Wnt信号通路中的Wnt4实现的。由于赶黄草包含的药理和化学成分比较复杂，不能明确赶黄草的哪种成分发挥抗肺纤维化作用，因此，后续将继续对赶黄草的药理进行研究，以期待找出赶黄草抗纤维化的有效成分，为治疗肺纤维化提供新的候选药。