大黄素诱导人肝癌索拉菲尼耐药细胞凋亡的作用机制

俞清江 张浩 王清清

肝癌是导致恶性肿瘤相关死亡的第三大病因［1］。多数患者发现时往往已是中晚期，或失去手术机会，即使行根治性手术，5年内复发转移率高达60%～70%，预后极差［2-4］。索拉菲尼（Sorafenib）是晚期肝癌的一线推荐用药［5］，但长期使用可引起患者耐药，其疗效有所限制。研究表明，大黄素（Emodin）可作为辅助用药增强化疗药物的敏感性［6］，其广泛存在于大黄、虎杖、何首乌等中药材中，是一种天然蒽醌衍生物，目前已被用于胰腺癌、胃癌、直肠癌等多种恶性肿瘤的临床治疗［7-8］。本研究初步探讨大黄素增强肝癌索拉菲尼耐药细胞对索拉菲尼的药物敏感性的作用机制，为临床上治疗晚期肝癌索拉菲尼耐药提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人肝癌Huh7细胞株，购自中国科学院上海生命科学院细胞所；胎牛血清（FBS），购自美国Gibco公司；DMEM/F12培养基，购自美国Hyclone公司；大黄素（Emodin）购自成都普瑞法科技开发有限公司；一抗兔抗人Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax、Caspase3、GAPDH均购自美国Abcam公司；RIPA裂解液、胰酶细胞消化液、PMSF、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、Annexin-FITC凋亡试剂盒均购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 研究方法 （1）细胞培养：本课题组前期已用浓度递增诱导法成功诱导人肝癌Huh7SR细胞［9］，使用含10% FBS的DMEM/F12培养基，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养Huh7SR细胞，取生长状态良好、对数生长期的Huh7SR细胞经胰酶消化后，制成浓度5×104/L的细胞悬液，之后接种于96孔板上，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，丢弃培养液，加入不同浓度（10 μM、20 μM、30 μM、40 μM、50 μM）大黄素的培养基作为实验组，不含Emo的培养基作为对照组，只含培养基无细胞为空白组，各组干预48 h。……