1例猪伪狂犬病病毒的分离与鉴定

颜友荣 方向红 王琳琳

江苏农牧科技职业学院，江苏泰州225300

伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（pseudorabies vi⁃rus，PRV）引起的一种重要传染病，以发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要症状的一种重要传染病[1]。近年来，我国许多省份的养猪场都出现了伪狂犬病，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[2]。为了了解伪狂犬病的感染情况，笔者从江苏省某猪场采集疑似病料，并对其进行病毒分离与鉴定，从而判断是否为伪狂犬病，以期为猪场控制伪狂犬病提供一定的帮助。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）病料与实验动物。从江苏某猪场采集疑似感染伪狂犬病的病料，如脑、肺脏、脾脏、肝脏、淋巴结等，-20°C 保存备用；实验动物为家兔，购自江苏农牧科技职业学院实验动物饲养中心；3 只健康家兔。

2）主要试剂。LA Taq DNA 聚合酶，dNTP mix，2×GC Buffer I，DL 5000 DNA Marker 等，购于宝生物工程（大连）有限公司；伪狂犬-SD 株由江苏农牧科技职业学院微生物实验室保存；其他各种实验试剂均为分析纯试剂。

1.2 方 法

1）病料处理。将无菌采集的病料组织研磨，用0.01 mol/L、pH7.4 PBS 按照体积比制成1∶5 组织悬液，加入适量青霉素、链霉素处理后，反复冻融3次，3 000 r/min离心15 min，取上清液，置于–20 ℃冰箱中保存备用。

2）病毒提取与PCR 扩增。取经处理过的病料上清液与对照伪狂犬-SD株，按照TaKaRa试剂盒说明书操作方法进行病毒提取，提取液-20 ℃贮存备用。PCR 扩增以提取液作为模板进行扩增。上游引物（P1）：5’-CCATGCGGCCCTTTCTGCTGC-3’，下游引物（P2）：5’-CGGGGCGGGACATCAACAG⁃GC-3’，扩增片段大小为1 737 bp，引物由上海英骏生物工程有限公司合成。

PCR 反应体系（50µL）：DNA 模板5µL，5 U/µL LA Taq 酶0.5 µL，2×GC Buffer I 25 µL，100 µmol/L dNTP 8 µL，PRV-P1 1 µL，PRV-P2 1µL，2 mmol/L MgCl26µL，ddH2O 3.5µL。

PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃预变性1 min，64 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，35个循环，最后4 ℃保存。……