小麦响应禾谷镰刀菌侵染的转录组学研究进展

李东翱，刘慧泉，王秦虎

西北农林科技大学植物保护学院，陕西杨凌712100

小麦是我国最重要的粮食作物之一，其产量与品质受到高度重视[1]。小麦在整个生长周期内受到各种病害的威胁，其中小麦赤霉病（Fusarium head blight,FHB）是影响最为严重的病害之一。该病害造成的危害是多方面的，可导致小花不育、穗轴变色、枯萎，致使小麦籽粒产量下降[2]。此外，赤霉病发展过程中伴随大量真菌毒素累积，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA），会显著降低谷物品质，人畜食用被毒素污染的谷物会严重损害身体健康[3]。为此，国际粮食机构对可流通的粮食产品中毒素含量制定了严格的标准[4]。

小麦赤霉病的主要病原菌是禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）。禾谷镰刀菌有性生殖产生的子囊孢子是小麦赤霉病的主要初侵染源[5]。子囊孢子在风力作用下接触到小麦穗，遇到合适的条件萌发并产生侵染菌丝。菌丝最初不会直接穿透寄主表皮，相反，它们在小花和颖片的外表面上生长，并向花序内的气孔和其他部位延伸。之后，菌丝在颖片表皮和表皮细胞壁之间形成特殊的侵染结构穿透表皮侵入细胞内。菌丝还可以直接穿过气孔或薄壁组织侵入细胞，最终定殖于小麦穗部，造成穗部枯萎[6-7]。禾谷镰刀菌以有性繁殖产生的子囊壳在土壤或植物病残体中越冬，并在来年春季开始新的病害循环[5]。

一些唑类杀菌剂对禾谷镰刀菌有良好的防治效果，也是目前主要的防治方法。轮作、土壤消毒等措施[8-9]也可在一定程度上减少赤霉病的发生。但是这些方法也存在一些不足的地方，如喷洒唑类杀菌剂的覆盖率和时机难于把握[10]。总体而言，培育抗性品种仍是未来有效防治赤霉病的最佳策略[9,11]。为此，研究者一直致力于小麦抗赤霉病品种的培育。苏麦3号和望水白具有良好赤霉病抗性[8]，也在抗病育种中得到了广泛的应用。然而，由于受赤霉病抗源利用效率低、表型鉴定变异大以及抗性和丰产性难以有效结合等因素影响，致使抗病品种培育困难重重。

随着禾谷镰刀菌与小麦基因组序列的公开发表[12-13]，以及基因芯片[14]、RNA-seq技术的成熟与发展[15]，科学家们应用转录组学对真菌与作物的相互作用进行了广泛而深入的研究。这些研究使我们对病原菌侵染和寄主防御的分子机制有了更加深刻的认识，可帮助我们了解小麦抗FHB的潜在机制、鉴定与FHB抗性相关的基因，以更好的促进抗FHB小麦品种的培育。综述小麦响应禾谷镰刀菌侵染的转录组学研究进展，有望为更好地研究小麦抗FHB机理与赤霉病的防治提供一些新的视野。

大量转录组学研究发现，小麦受到禾谷镰刀菌侵染后，其基因表达发生了大量变化。不同抗性品种、穗部器官、籽粒发育时期的小麦穗部组织受到禾谷镰刀菌侵染时的基因表达情况、以及禾谷镰刀菌侵染时小麦的激素响应、信号传导、转录调控和防卫相关基因的表达情况均不相同（表1）。

表1 禾谷镰刀菌侵染时小麦差异表达基因和差异累积代谢物Table 1 Differentially expressed genes and differentially accumulated metabolites in wheat during Fusarium graminearum infection

1 抗、感FHB小麦品种（系）在禾谷镰刀菌侵染时的转录组差异

研究者根据小麦对FHB的抗性，将FHB抗性归纳成五类，即抗侵入、抗扩展、籽粒抗性、耐病型和抗毒素积累[16]。目前已经鉴定出了一些抗FHB的小麦品种，它们携带有与小麦抗FHB扩展相关的数量性状位点（QTL）[17]。通过对携有主效抗扩展QTL的苏麦3号和3个加拿大小麦品种进行转录组比较分析，发现植物激素水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）正调控小麦对赤霉病的抗性，而生长素（AUX/IAA）和脱落酸（ABA）可能与赤霉病的感病性相关；此外，乙烯（ET）似乎在小麦对赤霉病的抗性和感病性中起双重作用[18]。苏麦3号与感病品种Roblin的代谢组差异主要集中在苯丙烷和类黄酮代谢物上[19]。通过比较携带不同FHB抗性QTL的Nyubai、Wuhan 1、HC374小麦和感病小麦Shaw的转录组，发现侵染2 d的感病小麦品种中许多丝氨酸/苏氨酸激酶、具有PAMP识别功能的亮氨酸重复（LRR）受体激酶（RK）基因上调[20-21]。而在侵染4 d后，许多ET响应基因、WRKY、Myb、bZIP和NAC转录因子基因在感病品种中上调[21]。研究者还发现，这3种小麦（Nyubai、Wuhan 1、HC374）的FHB抗性与一些谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、膜蛋白和一些不同的LRR-RK（leucine-rich receptor-like kinase）基因相关[21]。

2 小麦穗不同器官在禾谷镰刀菌侵染时的转录组差异

小麦穗主要由6个不同的器官组成，包括颖片、外稃、内稃、花药、子房和穗轴。禾谷镰刀菌侵染后，许多PR蛋白、热休克蛋白、R蛋白同源蛋白、活性氧爆发、蛋白合成和PAL途径基因显著上调[22]。该团队研究发现，禾谷镰刀菌侵染时，苞片组织（颖片、外稃和内稃）的基因表达模式相似，且与穗轴的基因表达模式相近；子房和花药则表现出独特的基因表达模式[22]。在75个差异表达的unigenes中，颖片和穗轴特异的unigenes分别有22和21个，而子房特异的unigenes只有4个[22]。有意思的是，一些WRKY转录因子基因特异在穗轴侵染时上调[22]。因此，小麦穗部不同器官应对禾谷镰刀菌侵染的转录组反应不尽相同。

3 小麦籽粒不同发育时期在禾谷镰刀菌侵染时的转录组差异

利用禾谷镰刀菌接种感病小麦Recital籽粒的5个不同发育阶段（胚乳细胞分裂阶段/50℃d、胚乳细胞分化阶段/150℃d、灌浆开始/250℃d、灌浆结束/350℃d、450℃d）并对其进行转录组分析，共鉴定出差异表达基因1 309个，其中受禾谷镰刀菌特异影响的有536个[23]。这些特异诱导的基因大多参与植物对真菌的防卫反应、谷胱甘肽代谢过程、ATP分解代谢过程、JA响应、BR代谢过程等[23]。值得注意的是，其中有40个基因可能与DON毒素解毒相关，如UDP-glycosyltransferases、Glutathione S-transferases、Cytochromes P450、PDRs等[23]。通过双因素方差分析，该研究还鉴定出了172个依赖于小麦籽粒发育状态的侵染响应基因[23]。根据基因表达模式的差异，可将这172个基因分为五类：第一类基因在侵染响应后期（灌浆结束时期）急剧下调，这类基因主要参与信号转导、基因表达调控和淀粉合成；第二类为11个早期侵染响应（胚乳细胞分裂阶段）基因，其大多数功能未知，有3个基因与侵染过程中的激素响应和信号传递有关；第三类和第五类基因响应侵染较迟（灌浆结束时期上调），其功能主要和药物响应、糖代谢、糖转运、糖酵解以及基因表达调控相关；第四类在响应侵染中期（灌浆开始时期）下调、却在后期（灌浆结束时期）上调，该类基因没有明显的功能富集[23]。

4 禾谷镰刀菌侵染时小麦激素信号途径相关基因的表达特征

禾谷镰刀菌侵染小麦可以激活植物激素信号传导途径，诱导植物产生防御反应[24]。这些植物激素可作为信号分子，并通过复杂的信号转导途径调控抗病相关的基因表达或抑制感病相关基因表达，从而抵御病原菌的入侵[25]。深入研究各激素信号途径响应禾谷镰刀菌侵染的分子机制，可帮助我们更好地理解这一复杂关系，设计出更有效、更精确的防治策略。

4.1 水杨酸(SA)

对苏麦3号和感病品种Stettler、Muchmore进行转录组分析显示，差异表达的激素相关基因中与SA信号产生相关的基因是最多的。与感病品种Stettler、Muchmore相比，苏麦3号也有着较高的SA水平，说明SA浓度的持续升高与其抗病性增强有关[18]。望水白及其感病突变体Meh0106的转录组学研究表明，禾谷镰刀菌侵染时望水白中SA途径被迅速激活，而Meh0106中SA途径的激活被延迟[26]。禾谷镰刀菌为半活体营养真菌，其侵染早期存在短暂的活体寄生阶段。这些转录组研究的结果都与SA信号途径在抵御活体营养型病原菌的作用是相吻合的[27]。相应地，无论是在小麦中表达拟南芥NPR1基因，还是直接通过土壤浸透施加SA，均可增加小麦对FHB的抗性[28-29]。而望水白与其感病突变体NAUH117之间在SA途径上并无差异[30]，这可能是由于望水白的数量抗性复杂，而NAUH117突变的基因与SA并无直接关系造成的，与其他研究结果并不冲突。

4.2 茉莉酸(JA)

茉莉酸途径也在小麦抗FHB过程中起重要作用[31-32]。苏麦3号受到禾谷镰刀菌侵染后，JA信号转导和应答途径相关基因的激活比其他感病品种（Stettler、Muchmore）更快、更强，JA信号转导相关基因表达水平比这些易感品种高至少3倍[18]。在望水白转录组中共鉴定到25个与JA途径相关的基因，包括14个负责JA生物合成的基因（LOX、AOS、AOC和OPR3）[33]，以及11个参与JA信号转导的基因（COI1、JAZ和MYC2）[34]，这些JA合成基因如LOX与OPR3在望水白与NAUH117中差异表达[30]。有趣的是，负责JA信号传导的1个COI1和3个JAZ基因仅在望水白中表达[30]。这表明望水白中JA信号转导途径正常运转，而感病品种中JA信号途径极有可能被阻断[30]。与这些结果一致，在小麦穗上外源添加MeJA可增强寄主对FHB的抗性[28]。

4.3 乙烯(ET)

苏麦3号转录测序表明ET途径正调控小麦对FHB的抗性[18,32]。望水白及其感病突变体Meh0106的转录组分析结果也显示，ET途径正调控小麦对FHB的抗性。然而，在望水白及其感病突变体NAUH117中，尽管其ET生物合成途径均响应禾谷镰刀菌侵染，但只有NAUH117的ET信号转导途径上调[30]，表明ET途径可能负调控小麦对FHB的抗性。类似地，Pan等[21]发现ET途径基因高表达与Shaw的感病性相关。不仅如此，研究者还发现禾谷镰刀菌可以利用ET信号途径促进其在拟南芥和小麦上的定殖[35]。一般认为，ET信号激活对腐生性较强的病原菌具有防御作用[36-37]，目前的研究表明乙烯对小麦抗赤霉病可能具有双重作用[26,32]。有观点认为，在苏麦3号中，ET在侵染早期正调控小麦对FHB的抗性；在侵染后期，ET则通过促进组织衰老促进小麦感病[18]。

4.4 脱倍酸(ABA)

ABA可通过关闭气孔防止病原菌进入或拮抗SA/JA促进植物感病[38]。由于禾谷镰刀菌很少通过气孔侵入小麦穗部，所以ABA介导的气孔关闭对小麦防御FHB几乎没有影响。对Nyubai、Wuhan1、HC374和Shaw的转录组研究发现，在禾谷镰刀菌侵染时，许多与ABA相关的基因上调，并在感病品种Shaw中表达更高，这表明ABA可能促进了小麦对FHB的感病性[21]。研究者通过甲基转移酶抑制剂5-methyl-azacytidine处理硬粒小麦以改变其胞嘧啶DNA甲基化，获得了一些具有FHB抗性的硬粒小麦材料。对该小麦材料的转录组研究发现，许多与ABA相关的基因在禾谷镰刀菌侵染时下调表达，表明ABA可能负调控小麦对FHB的抗性[39]。对苏麦3号的转录组分析发现，在受到禾谷镰刀菌侵染时，尽管ABA信号激活与响应相关的基因上调，但是其生物合成与代谢相关的基因下调；进一步的ABA含量测定结果表明苏麦3号在侵染4 d时ABA累积显著低于感病品种[18]。加之外源施加ABA可增加小麦对FHB的感病性[40-41]，可以认为，ABA负调控小麦对FHB的抗性。

4.5 生长素(AUX/IAA)

生长素除了有调节茎的生长速率、抑制侧芽、促进生根的作用，也参与植物防御反应[42-43]。感病小麦品种Roblin在禾谷镰刀菌侵染后，IAA大量累积[41]。转录组研究发现，苏麦3号被禾谷镰刀菌侵染后IAA合成基因上调，且感病品种Muchmore积累了较多的游离IAA，表明IAA可能与小麦对FHB的感病性有关[18]。对Nyubai、Wuhan1、HC374和Shaw的转录组研究发现，禾谷镰刀菌侵染后IAA的合成、外排基因均上调，许多生长素反应因子下调、IAA活性负调控基因上调，在感病品种Shaw中这种现象更加明显，表明植物可能在试图克服IAA的不利影响[21]。这些研究结果表明IAA途径与FHB感病性相关。

5 禾谷镰刀菌侵染时差异表达的小麦信号通路基因

小麦受到禾谷镰刀菌侵染后，钙离子和活性氧/一氧化氮等信号分子调控基因往往被诱导，它们在调控抗赤霉病及激活相关防御网络过程中起了重要的作用[21,26,44-46]。

5.1 Ca2+信号转导

Ca2+作为细胞内的第二信使，与植物体内许多重要的信号转导途径有关[47]。植物受到病原菌侵染及高盐、干旱、冷冻等胁迫下均可以诱导细胞内Ca2+浓度的增加，随后激活钙依赖的蛋白激酶，从而调控下游信号[48]。在望水白及其感病突变体NAUH117的比较转录组研究中，发现在禾谷镰刀菌侵染后，质膜Ca2+浓度调节基因PMCA，以及与Ca2+信号转导相关的许多CaM、CDPKs、CIPK和CaSR基因均差异表达[30]。类似地，望水白和感病突变体Meh0106的比较转录组学研究、以及具有FHB抗性硬粒小麦突变体的转录组学研究均表明，小麦与禾谷镰刀菌互作中Ca2+信号转导途径被激活[26,39]。

5.2 ROS/NO反应

活性氧（ROS）与一氧化氮（NO）是重要的信号分子，参与许多重要生物反应的信号转导。在病原菌侵染时，ROS、NO会在短时间内大量产生，与植物基础防卫相关[49-51]。在小麦与禾谷镰刀菌互作时，许多ROS/NO产生及清除系统基因的表达显著改变，并且在抗FHB和感FHB的小麦中明显不同[26,30]。这些基因主要包括活性氧产生与清除的NOX、APX、POD、GPX、SOD、CAT,NO产生与清除的NOS、PRX等[26,30]。

6 禾谷镰刀菌侵染时差异表达的小麦转录因子基因

植物受到环境胁迫时，会合成大量的转录因子，用以调控特定基因表达并传递胁迫信号，从而激活植物的防御反应[52]。转录因子在小麦与禾谷镰刀菌互作中扮演着重要的角色。例如，小麦转录因子TaWRKY45受禾谷镰刀菌侵染诱导表达，在小麦中过表达TaWRKY45可增加寄主对FHB的抗性[53]；类似的，利用VIGS沉默TaWRKY70可降低下游相关基因TaACT、TaDGK和TaGLI1的表达，从而破坏小麦对FHB的抗性[54]。转录组学研究发现，大量转录因子参与小麦与禾谷镰刀菌互 作。对Nyubai、Wuhan1、HC374和Shaw 4个小麦品种的转录组研究发现，在禾谷镰刀菌侵染时，一些Ethylene-responsive、WRKY、Myb、bZIP和NAC类型转录因子的表达与小麦对FHB的感病性相关[21]。对具有FHB抗性硬粒小麦突变体的转录组学研究发现，许多不同类型的转录因子基因在禾谷镰刀菌侵染时差异表达，包括13个bZIP家 族 转 录 因 子，26个AP2/EREBP(ERF)家族转录因子，以及32个WRKY家族转录因子[39]。

7 禾谷镰刀菌侵染时小麦防卫相关基因的表达特征

7.1 病程相关（pathogenesis-related,PR）蛋白

PR蛋白是植物在病原菌胁迫下产生的一类直接抵御病原菌的蛋白质。2000年，研究者通过RT-PCR发现小麦中许多PR基因，如PR-1、PR-2、PR-3、PR-4、PR-5，在禾谷镰刀菌侵染早期上调；且相比于感病品种Wheaton，苏麦3号的PR-4和PR-5上调更早、更高[55]。比较转录组学研究中发现，望水白和感病突变体NAUH117中许多PR-2、PR-3、PR-5、PR-14发生差异表达[30]。对Nyubai、Wuhan1、HC374和Shaw的转录组研究发现，在禾谷镰刀菌侵染下，有47个PR1、PR1-1和PR-4基因被禾谷镰刀菌诱导表达[21]。与之一致，在具有FHB抗性硬粒小麦突变体的转录组学研究中，共鉴定出49个差异表达的PR基因[39]。

7.2 富含亮氨酸重复受体激酶(LRR-RK)

LRR-RK在植物发育和免疫中发挥重要作用[56]。对Nyubai、Wuhan1、HC374和Shaw的转录组研究发现，在禾谷镰刀菌侵染下，多种LRR-RKs基因被诱导表达[21]。同样的，在具有FHB抗性硬粒小麦突变体的转录组学研究中，也发现了许多包含LRR结构域的基因差异表达[39]。TaLRRK-6D，一个在禾谷镰刀菌侵染早期被诱导的禾本科特异受体激酶基因，其沉默后小麦对FHB感病性明显增加，表明TaLRRK-6D正调控小麦对FHB抗性[57]。

7.3 苯丙烷代谢途径（PAL）

PAL途径在寄主对病原菌的防卫中起重要作用。代谢组研究发现抗性小麦苏麦3号对FHB的抗性主要是由于苯丙烷和类黄酮代谢物相关联[19]。与之一致，许多苯丙烷和类黄酮代谢通路的基因在小麦与禾谷镰刀菌互作中差异表达。例如，比较转录组学研究发现PAL途径关键基因CCoMT在抗性小麦望水白中的表达水平远高于其在感病突变体Meh0106的表达水平[26]。对具有FHB抗性硬粒小麦突变体的转录组学研究表明所有受影响的181个次生代谢基因中，有将近三分之一的基因为PAL途径基因[39]。同样的，对冬小麦抗病品种Centenaire的转录组研究，发现接种禾谷镰刀菌后PAL途径基因C4H上调表达[58]。对Nyubai、Wuhan1、HC374和Shaw 4个小麦品种的转录组学研究发现，接种禾谷镰刀菌后，其芳香族氨基酸代谢相关基因，特别是色氨酸生物合成相关的基因上调表达[21]；而色氨酸是许多苯丙烷和木质素的前体，它们有助于强化初级细胞壁，并参与阻止真菌在植物组织中的扩增[59]。

8 展望

近年来,应用转录组学技术分析小麦与禾谷镰刀菌的互作，为我们带来了很多新的见解。通过比较抗、感FHB小麦品种的转录组，发现不同FHB抗性品种有着不同的抗病策略，不同的抗病策略有不同的基因转录特征。这些研究厘清了赋予小麦抗FHB的主要途径，也明确了导致小麦感FHB的相关因子。通过比较禾谷镰刀菌侵染时小麦穗上不同器官的转录组差异，确认了小麦不同组织对FHB抗性的差异，也明确了小麦不同组织应对禾谷镰刀菌侵染的不同转录组特征。比较小麦籽粒不同发育时期在禾谷镰刀菌侵染时的转录组差异，鉴定了一系列不同籽粒发育时期响应禾谷镰刀菌侵染的特异基因和生物学过程。

通过分析感染FHB的小麦转录组，使我们对小麦防御禾谷镰刀菌的分子机制有了更全面的认识，了解了FHB感染时小麦的激素响应、信号传导、转录调控和防卫相关基因的表达与FHB抗性的联系。对禾谷镰刀菌侵染时差异表达的小麦激素信号途径相关基因、代谢物研究表明：SA激素途径及JA激素途径与小麦抗FHB密切相关，而IAA激素途径、ABA激素途径与小麦感FHB有关，ET激素途径则具有双重作用。小麦响应禾谷镰刀菌侵染的主要基因还包括一些Ca2+信号转导途径基因、ROS/NO反应相关基因、WRKY与bZIP转录因子基因、PR基因、LRR-RK基因，以及PAL途径相关基因。

目前，小麦响应禾谷镰刀菌侵染的转录组研究已取得了巨大进展，但是依然有需要进一步研究或改进的地方。首先，由于不同实验室所使用的小麦材料、禾谷镰刀菌菌株、接种方法、取样时间、测序平台、数据分析方法的差异，使得这些不同的转录组分析结果之间难以比较，未来应当进一步寻找不同转录组分析的同质化方法，或者使用相同或类似的对照实验。其次，考虑基因表达水平有时与其蛋白累积水平不成正比，加之一些翻译后修饰的存在，未来应当多开展转录组-蛋白组-代谢组联合分析，以全面揭示研究对象的调控规律。此外，尽管通过转录组分析已鉴定出许多潜在的对FHB抗性具有不同调控作用的基因，但迄今为止，只有少数基因通过在植物中过表达和沉默进行了功能验证。对这些基因功能的深入解析，有望揭示其参与小麦对FHB抗性的分子机理，并为将来通过基因编辑等手段防控小麦赤霉病提供新的候选基因。