离子色谱法测定母乳和牛乳中的N-乙酰神经氨酸

刘 爽，陈 磊，Philip Haselberger，田 芳，蔡小堃，毛颖异，王 津，赵艳荣*，王 硕*

（1 南开大学医学院 天津市食品科学与健康重点实验室 天津300350 2 雅培营养中国研发中心 上海200233 3 雅培营养品 美国哥伦布OH43219）

唾液酸（sialic acid，SA）是一类九碳糖的酰基衍生物，骨架由一分子丙酮酸和一分子甘露糖胺组成，现已发现60 多种唾液酸结构[1]。唾液酸大量存在于中枢神经系统中，是大脑中神经节苷脂和多聚唾液酸链的重要成分，参与修饰神经细胞黏附分子，在细胞间交流、神经元分支、修饰突触连接和记忆形成方面发挥重要作用[2]。动物试验表明，膳食中添加唾液酸，可增加大脑额叶皮质中唾液酸的含量，提高与学习相关的两个基因的表达，此外，唾液酸还参与抑制病原体在肠道上皮细胞上的黏附，其机制是作为肠道中的诱饵受体与细菌和病毒结合，阻止病原体在肠道中的附着[3-4]。

N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acids，Neu5Ac）是唾液酸家族中最主要的物质之一，在母乳中也仅检测到Neu5Ac 结构的唾液酸[5-6]。Neu5Ac 广泛存在于母乳及动物乳汁中，主要以结合态存在。母乳中的大部分Neu5Ac 结合到低聚糖（73%）和糖蛋白上（24%），少部分与糖脂结合或以游离态存在（3%）。牛乳中Neu5Ac 的分布鲜有研究报道。而以牛乳为基质的婴幼儿配方粉中，低聚糖和糖蛋白结合态的比例分别为28%和70%，仅2%与糖脂结合或以游离态存在[7]。准确测定不同泌乳阶段的母乳中Neu5Ac 含量，有助于进一步研究其在婴幼儿体内发挥的生理作用以及婴幼儿Neu5Ac 适宜摄入量的标准。通过对比两种乳汁中Neu5Ac 含量差距，为其在婴幼儿配方粉中的应用提供科学依据。

目前，测定乳汁中Neu5Ac 的方法主要有：分光光度法（spectrophotometric method）[8-9]、液相色谱法（liquid chromatography,LC）[6，10]、液相色谱-质谱联用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[11-12]和离子色谱法（ion chromatography,IC）[13-14]。传统的分光光度法灵敏度较低，无法区分不同结构的唾液酸，近年来应用很少。采用液相色谱法测定Neu5Ac 时，因Neu5Ac自身不存在发光基团，故需对其衍生处理。衍生增加了检测的特异性和信号强度，也增加了样品处理的复杂性和潜在的干扰因素。液相色谱-质谱联用法较液相色谱法的效果好，样品无需衍生，然而操作更为繁琐，对检测仪器及检测人员的专业性要求高。以上方法均不适用于母乳中高含量Neu5Ac 的测定。离子色谱法常用于碳水化合物的分离，样品无需衍生且检测灵敏度高，是检测母乳及牛乳样品中Neu5Ac 含量的较好选择。然而，目前应用离子色谱法检测Neu5Ac 的研究主要集中在乳粉基质中Neu5Ac 含量的测定[13]，尚未建立测定母乳基质中Neu5Ac 含量的方法，而且因母乳与乳粉中Neu5Ac 含量的差异，测定乳粉基质中Neu5Ac 方法的洗脱条件和分析范围并不完全适用于母乳。

为了准确检测不同泌乳阶段母乳中总Neu5Ac 的含量，本研究建立高效阴离子交换色谱偶联脉冲安培检测器法（high-performance anionexchange chromatography -pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD），优化洗脱条件和分析范围，并对方法的检出及定量限、回收率、精密度及应用范围进行验证。同时，应用此法测定不同泌乳阶段的母乳及常见市售牛乳中总Neu5Ac 含量。用本实验室建立的方法[15]测定母乳及牛乳中游离态Neu5Ac 的含量。

1 材料与方法

1.1 样品

脱脂乳粉（34%蛋白，52%乳糖），供应商提供；母乳样品：0～5 d 初乳、10～15 d 过渡乳、40～45 d 成熟乳、230～240 d 成熟乳和365～375 d 成熟乳各3例，所有母乳样品均来自于单胎足月分娩的健康产妇，分娩于天津市南开医院；5 种牛乳样品均为市售产品，基本信息见表1。

表1 牛乳样品营养成分表（100 mL）Table 1 Nutrition information of cow's milk production（100 mL）

1.2 试剂与仪器

氢氧化钠溶液（质量分数50%）、乙酸钠和硫酸，分析纯，购于美国Sigma-Aldrich 公司；N-乙酰神经氨酸标准品，分子式C11H18NO9，分子质量309.27，纯度≥98%，购于加拿大Toronto Research Chemicals 公司。

Dionex ICS-5000 离子色谱仪（配有四元梯度泵、脉冲安培检测器和Chromeleon 6.8 色谱工作站），美国Thermo Fisher 公司；Milli-Q Advantage A10 超纯水仪，美国Millipore 公司；Thermo REL5004V 冰箱、CarboPacTMPA1 离子色谱柱（4 mm×250 mm）、CarboPacTMPA1 保护柱（4 mm×50 mm），美国Thermo Fisher 公司；移液器（1 mL），德国Eppendorf 公司；尼龙滤膜（0.2 μm），英国Whatman 公司；Microman CP250 毛细吸管和活塞，美国Gilson 公司；离子色谱进样小瓶和聚丙烯瓶盖，美国Agilent 公司。

1.3 离子色谱测定条件

离子色谱柱CarboPacTMPA1（4 mm×250 mm），保护柱CarboPacTM PA1（4 mm×50 mm）；柱温25 ℃；检测器温度25 ℃；流量1 mL/min；进样量5 μL；淋洗液为水、500 mmol/L 氢氧化钠溶液和300 mmol/L 乙酸钠溶液，梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序Table 2 Program of gradient elution

1.4 样品预处理

准确量取100 μL 母乳/牛乳样品于塑料离心管中，加入900 μL 100 mmol/L 硫酸，涡旋混匀后放入烘箱中，80 ℃酸解1 h。酸解后加入超纯水定容至10 mL，待静置至室温后用0.2 μm 尼龙滤膜过滤后即可进样分析。

1.5 统计分析

采用SPSS 25.0 进行数据处理与分析，不同泌乳阶段的母乳中Neu5Ac 的含量使用平均值±标准偏差（standard deviation,SD）表示。

2 结果

2.1 标准曲线的线性范围

如表3所示，通过标准系列工作液做线性，Neu5Ac 在设定的浓度范围内线性良好，相关系数大于0.999，线性范围以母乳样品计算。

表3 Neu5Ac 的线性范围与标准曲线Table 3 The linear range and standard curve of Neu5Ac

2.2 检出限及定量限

方法定量限的计算是根据在基质溶液中加标给定低质量浓度，检出限为加标给定低质量浓度时，Neu5Ac 色谱峰信噪比为3 时对应的浓度，因母乳中含有高含量的Neu5Ac，不适用于检出及定量限的评估，因此选用乳粉作为基质（乳粉与超纯水按比例为1.5∶10 冲配）验证方法的检出及定量限。在基质中加标Neu5Ac 20.7 mg/L 后，回收率在96.1%～99.8%之间，3 次测定的RSD 为1.9%（表5），因此，加标量20.7 mg/L 可以作为方法的定量限，3 倍信噪比计算方法检出限为4.3 mg/L（表4）。

表4 检出限的验证Table 4 Validation results of LOD

表5 定量限的验证Table 5 Validation results of LOQ

2.3 精密度与回收率

精密度的评估通过测定成熟母乳中Neu5Ac的含量，6 次重复测定的质量浓度分别为：415，439，409，405，400，412 mg/L，平均质量浓度406 mg/L，RSD 为1.9%。方法回收率的计算是通过加标母乳基质中Neu5Ac 的浓度的50%和100%，每个浓度的加标量重复测量3 次，RSD 低于6.5%，回收率在86.1%～99.3%之间，平均回收率为92.7%（表6）。

表6 回收率的验证Table 6 Validation results of recovery

2.4 母乳及牛乳中的应用

应用此方法与已发表的方法[15]测定了母乳（表7）及牛乳（表8）中总Neu5Ac 及游离态的含量。产后1年内，母乳中总Neu5Ac 的含量范围在187.1～1 334.7 mg/L，游离态Neu5Ac 的含量范围在4.6～12.7 mg/L，游离态及总Neu5Ac 的含量均沿哺乳期呈下降趋势，游离态Neu5Ac 占总Neu5Ac的比例在1.05%～2.5%。5 种市售牛乳中总Neu5Ac的含量范围在177.6～228.9 mg/L，游离态Neu5Ac的含量范围在15.9～21.9 mg/L，游离态Neu5Ac 的比例在8.5%～11.2%。母乳及牛乳中总Neu5Ac 的含量均高于方法的定量限并处于方法的分析范围内。

表7 不同阶段母乳中游离态及总Neu5Ac 的含量（mg/L）Table 7 The concentration of free and total Neu5Ac in human milk over 1 year（mg/L）

表8 市售牛乳中游离态及总Neu5Ac 的含量（mg/L）Table 8 The concentration of free and total Neu5Ac in commercially available cow milk（mg/L）

含量对比发现，泌乳前期的母乳中总Neu5Ac的含量远高于牛乳，母乳中总Neu5Ac 的水平沿哺乳期下降，365～376 d 母乳中总Neu5Ac 的含量与牛乳接近。牛乳中游离态Neu5Ac 的含量和比例均高于母乳，牛乳中游离态Neu5Ac 的比例在8.5%～11.2%，在母乳中仅为1.0%～2.5%。

3 讨论

本研究建立并验证了离子色谱法测定母乳及牛乳中总Neu5Ac，方法的样品预处理操作简单，使用酸解法释放乳汁中的Neu5Ac，无需衍生及后续纯化操作，稀释过滤后进样。淋洗液选择氢氧化钠和洗脱能力较强的乙酸钠，采用梯度洗脱方式分离Neu5Ac。方法具有较宽的分析范围（20.7～4 000 mg/L），且线性关系良好，相关系数大于0.999。方法较灵敏，母乳样品中的检出及定量限分别为4.3 mg/L 和20.7 mg/L，可满足不同泌乳阶段的母乳及牛乳样品中总Neu5Ac 含量的检测。准确性和精密度良好，母乳中Neu5Ac 在不同浓度水平的加标回收率均在90%～110%之间，加标回收含量的RSD 低于6.5%，重复测量含量的RSD 低于1.9%。通过测定不同阶段的母乳及市售牛乳中总Neu5Ac 的含量，考察了方法的适用范围，结果表明，方法的定量限及分析范围可用于不同乳汁中总Neu5Ac 的检测。

本研究测定的母乳中总Neu5Ac 的含量范围在187.1～1 334.7 mg/L，其中0～5 d 母乳中含量最高（1 334.7 mg/L±171.2 mg/L），365～375 d 母乳中最低（187.1 mg/L±72.1 mg/L）。本研究测定的不同阶段母乳中总Neu5Ac 的含量与文献报道中初乳（1 240 mg/kg ± 229 mg/kg）、过渡乳（881 mg/kg ±273 mg/kg）及成熟乳（505 mg/kg ± 251 mg/kg）中的数据接近[16]。对比不同检测方法，本研究使用离子色谱法测定的初乳中总Neu5Ac 含量与金宇婷等[9]通过分光光度法，Claumarchirant 等[17]使用高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FLD）测定的范围一致。本研究测定的牛乳中总Neu5Ac 的含量范围在177.6～228.9 mg/L，平均含量为（195.7±19.7）mg/L，与使用HPLC-FLD 法测定的牛乳中总Neu5Ac 的含量（186～218 mg/kg）接近[18]，其略微的差异可能来源于牛的品种、牛乳的阶段及加工工艺的不同。

Neu5Ac 作为重要的营养元素参与婴幼儿大脑及认知的发育，母乳中富含大量的Neu5Ac，可满足婴幼儿生命早期快速的生长发育，特别是大脑的发育，对营养及其前体物质提出了极高的需求[2]。初步测定的结果表明，牛乳中总Neu5Ac 含量远低于早期母乳，接近365～375 d 母乳中Neu5Ac 的含量。婴幼儿配方粉通常以牛乳为基质，由于一些原因不能采用母乳喂养的乳母，通常选择乳粉喂养婴幼儿，但牛乳中总Neu5Ac 水平低于母乳，导致婴幼儿配方粉中总Neu5Ac 的含量较低，为了进一步贴近母乳喂养效果，需在婴幼儿配方粉中添加Neu5Ac 以确保婴幼儿生命早期大脑快速发育阶段的适龄生长。Neu5Ac 在婴幼儿配方粉中添加的前提是明确其在母乳中的含量，而近年来国内还未开展大样本量的母乳中总Neu5Ac 含量的研究，但本研究为大样本量测定母乳中总Neu5Ac 提供了一种准确快速的方法。

本研究建立的方法未来还可进一步优化以测定母乳中不同结合态（低聚糖、糖蛋白和糖脂结合态）的含量及比例，深入分析母乳中Neu5Ac 的分布。初步测定结果表明，母乳中游离态Neu5Ac 仅占总含量的1.0%～2.5%，97.5%～99.0%的Neu5Ac以结合态存在，不同结合态可能导致Neu5Ac 吸收及利用率的差异，进而影响其在婴幼儿体内发挥的生理作用。当前已有的母乳中不同结合态Neu5Ac 分布的研究多集中在2000—2010年期间，近年来及国内母乳中Neu5Ac 的分布还未见报道，方法可进一步优化样品前处理过程及分析范围用于母乳中不同结合态Neu5Ac 含量的测定。

4 结论

首次建立了离子色谱法测定母乳基质中总Neu5Ac，方法具有良好的准确性和精密度，较低的检出及定量限，较宽的分析范围，可用于准确高效地测定不同泌乳阶段母乳中总Neu5Ac 的含量。初步测定结果表明，母乳中总Neu5Ac 的含量沿泌乳期呈下降趋势，泌乳早期母乳中总Neu5Ac含量远高于牛乳，产后1年母乳中总Neu5Ac 含量接近牛乳，母乳中游离态Neu5Ac 的比例仅占1.0%～2.5%，未来需要更多的研究探明母乳中总Neu5Ac 的含量及不同结合态Neu5Ac 的分布。