HPLC法同时测定蟾灵膏中华蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒灵成分的含量

柏永淞，鲁 杰，陈 庚，叶定勋，杜典河，熊意陵，谢 丹，阮婧华

(1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550001)

蟾灵膏是国医大师刘尚义教授的临床常用膏方，是贵州中医药大学第一附属医院的特色膏方，该方在葛根散的基础上加用了蟾皮、威灵仙等中药，具有养阴活血，散结化癥的功效[1]。蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮。蟾皮性凉、味辛，有微毒性，有较强的药理活性，具有止毒消肿，止痛、开窍醒神、抗肿瘤等作用，在临床的应用较为广泛[2]。蟾皮作为蟾灵膏中的君药，其化学成分复杂，主要有蟾蜍甾二烯类、吲哚碱类、甾醇类化合物[2]。其中蟾蜍甾二烯类是蟾皮的主要化学成分，主要包括酯蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾毒精等化合物，此类成分具有升高血压、使呼吸兴奋的作用，还可治疗原发性肝癌、肺癌、肠癌[3-4]。本文旨对蟾灵膏中的三种有效成分华蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒灵采用HPLC法进行含量测定，为蟾灵膏的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪(Agilent Technologies 1260 Infinity Ⅱ)。甲醇(分析纯)乙腈(色谱纯)乙酸(色谱纯)。对照品：华蟾毒精(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20041609，纯度：HPLC≥98%)，酯蟾毒配基(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20062403，纯度：HPLC≥98%)，蟾毒灵(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq20061908，纯度：HPLC≥98%)。样品：蟾灵膏(批号：20200610、20200710、20200810)由贵州中医药大学第一附属医院制剂中心制备。

2 方法与结果

2.1 标准对照品的制备 精密称取经60℃干燥24 h后的对照品华蟾毒精1.015 mg、酯蟾毒配基1.002 mg、蟾毒灵0.998 mg，用甲醇溶解并定容至2 ml容量瓶中，过0.45 μm微孔滤膜得标准对照液。

2.2 样品液的制备 称取三批次蟾灵膏20 g置100 ml具塞锥形瓶中，加入50 ml甲醇80℃回流提取1 h，过滤，滤液挥干，加入60 ml水饱和正丁醇萃取三次，每次20 ml，合并正丁醇层，将正丁醇层水浴挥干，加入甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中，过0.45 μm微孔滤膜即得样品液。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件 Eclipse XDB-C18(5 μm 4.6×250 mm)色谱柱，流动相为乙腈(A)-0.3%乙酸溶液(B)(46∶54)等度洗脱(0～20 min 46%A)，柱温为30℃，流速为1 ml/min，进样量为10 μl，检测波长为296 nm。

2.3.2 线性关系考察 分别取“2.1”项定容后的对照品，分别将华蟾毒精、酯蟾毒配基、蟾毒灵用甲醇稀释到不同浓度。按“2.3.1”项色谱条件进行分析处理，以对照品峰面积A对浓度C进行线性回归，得回归方程，见表1。

表1 华蟾毒精、酯蟾毒配基、蟾毒灵线性回归方程

2.3.3 稳定性试验 分别取“2.1”项定容后的对照品，按“2.3.1”项色谱条件进行分析处理，进样量10 μl，于0、2、4、6、8、10、12 h进样，12 h内按“2.3.1”项色谱条件进行分析处理，测得华蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒灵峰面积积分值的RSD值分别为2.77%、2.59%、1.99%，表明稳定性良好。

取“2.2”项样品，按“2.3.1”项色谱条件进行分析处理，进样量10 μl，分别于0、2、4、8、16、32 h进行测定，测得三批样品峰面积积分值的RSD值分别为2.87%、2.64%、2.07%，均小于3%，表明样品32 h内稳定性良好。

2.3.4 精密度试验 取“2.1”项样品，按“2.3.1”项色谱条件进行分析处理，与1 d内连续进样6次，计算精密度值，结果表明华蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒灵精密度分别为1.92%、2.18%、1.88%，RSD值均小于3%，表明精密度良好。

2.3.5 重复性试验 取同一份样品6份，按“2.3.1”项色谱条件进行分析处理，结果表明华蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒灵RSD值分别为1.76%、1.89%、1.64%，均小于3%，表明实验重现性良好。

2.3.6 加样回收试验 精密称取3批蟾灵膏5 g，并按“2.2”项下方法处理样品得样品液，分别加入华蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒灵对照品0.03 mg，制成供试品溶液。将供试品溶液按“2.3.1”项色谱条件进行分析处理，进样量10 μl，测得华蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒灵平均回收率分别为99.90%、102.60%、99.90%。表明本方法测得华蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒灵的准确性良好。

2.3.7 样品含量测定 精密吸取“2.1”项对照品，将3批蟾灵膏按“2.2”项样品处理方法处理得3批样品液，按“2.3.1”项色谱条件进行分析处理，进样量10 μl，结果见表2。

表2 蟾灵膏中3种成分测定(mg/g)

3 讨论

3.1 液相色谱条件的选择 参照《中国药典》2020版第一部“蟾酥”含量测定项下色谱条件：以乙腈：0.3%乙酸溶液(46:54)为流动相，检测波长为296 nm，结果3种成分对照峰能够完全分离，理论塔板数n>4 000,因此采用本法等度洗脱。采集的混合对照品如图所示，结果见图1。

图1 混合对照品HPLC图

3.2 供试品提取方法的选择 本次实验对蟾灵膏中蟾蜍甾二烯类提取曾用过不同的提取溶剂：水、甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇。结合不同提取的提取方式：超声提取、索氏回流提取。结果表明甲醇为溶剂提取效率最高，经过水饱和正丁醇萃取后提取效率更高。并且索氏回流提取法比超声提取法提取效率高。

考察了不同索氏回流提取时间15、30、45、60 min，结果表明15 min时提取完全不够，60 min提取效率最高，所以选择提取60 min。采集的样品如图所示，结果见图2。

图2 蟾灵膏样品HPLC图

干蟾皮是中华大蟾蜍的干燥皮，其有效成分与蟾酥类似，但是对于治疗癌症方面蟾皮的疗效由于蟾酥[5]，因此本院特色膏方——蟾灵膏以干蟾皮入药，原因于此。干蟾皮中所含的华蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒灵既是毒性成分又是有效成分，过量服用会对机体造成伤害，因此对其含量要把握准确，本实验方法简单、结果准确、重复性好、专属性高，结果也较为理想。该实验为蟾灵膏的质量控制提供参考。