红藤化学成分中端粒酶TERT基因激动剂的虚拟筛选

汤 建，徐滢滢，黄淑慧，刘 梦，曹裕旻，闻崇炜*

（1.亳州学院中药学院，安徽亳州 236800；2.江苏大学药学院，江苏镇江 212013）

红 藤（Sargentodoxacuneata（Oliv.） Rehd. et Wils.），又称大血藤，是一种我国特有的植物，中医临床常用于治疗阑尾炎、月经不调等。红藤提取物或红藤复方有良好的抗炎免疫等药理活性［1］。迄今已分离鉴定120 余种小分子化合物，主要包括酚酸类、苯丙素（木脂素）类、三萜、黄酮类等［2-3］。本课题组在前期研究中发现红藤提取物具有激活端粒酶的作用，但其中活性成分尚不明确。

端粒酶是细胞中负责染色体端粒延长的一种DNA 逆转录酶，其抑制剂可作为一类潜在的高选择性抗癌药物［4］；反之，激活端粒酶有助于端粒稳定，是延长细胞寿命、抗衰老的有效手段之一［5-6］。端粒酶中的逆转录酶（TERT）是其限速亚单位，是调节端粒酶活性的关键基因［4-5，7］。端粒酶特异性的抑制剂BIBR1532 就是通过和TERT 结合而发挥药理活性的［8］。目前，TERT 被认为是癌症靶向治疗高选择性的目标靶位，以TERT 为靶点的抗癌药物分子设计被广泛研究报道［4，7］。但通过激活TERT 来提高端粒酶活性的研究较少，目前仅报道过环黄芪醇等少数天然产物可以通过激活端粒酶发挥抗衰老作用［6，9］。中药中的某些成分可能通过上调TERT，激活端粒酶，具有稳定端粒、抗衰老的潜力，值得深入研究。

分子对接（Molecular docking）作为一种高效的辅助筛选手段，在中药活性成分筛选和靶点确证方面有着广泛的应用前景。针对某一特定的靶点蛋白，利用计算机技术对中药化合物库进行虚拟筛选，寻找与靶蛋白结合密切的候选化合物，进而采用生物模型测定其药理活性，最终筛选出具有活性的化合物［10-11］。为了发现红藤中潜在的抗衰老活性化合物，本研究中采用AutoDockVina 软件［12］，将检索到的红藤化合物（配体）与TERT 基因（受体）进行分子对接，根据结合能（打分值）虚拟筛选出潜在的端粒酶激活剂，也为阐明红藤的抗衰老活性机制提供一定的科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

采用ChemOffice2020中的ChemDraw和Chem3D模块（PerkinElmer 公 司），AutoDock Tools1.5.6 和AutoDockVina（The Scripps Research Institute），Pymol 1.8（DeLano Scientific LLC 公司）和Discovery Studio 2017R2 client（BIOVIA公司）等软件。

1.2 化合物结构的处理

ChemDraw 绘制红藤中126 个小分子化合物［2-3］的化学结构，采用Chem3D 模块进行MM2 处理，保存为mol2 格式。AutoDock Tools1.5.6 进一步处理上述配体，扭度（Torsion）设为默认值，最终保存为pd⁃bqt格式，以备分子对接。

1.3 靶标蛋白TERT结构的获取和预处理

通过检索PDB 数据库（http：//www.rcsb.org），获取靶点蛋白TERT 复合物（PDB ID：5CQG），将靶点蛋白导入AutoDock Tools1.5.6 中，删除原配体BI⁃BR1532 和水分子，加氢，保存为pdbqt 格式，利用AutoDockVina 软件进行半柔性对接，得到配体分子与靶点蛋白5CQG 对接后的结合能。将较高结合能（绝对值≥8.5 kcal/mol）的化合物认定为潜在的活性成分。

用AutoDock Tools1.5.6 软件将靶点蛋白晶体复合物中的原配体取出，再与受体重新对接，其结合能为阈值。同时分析对接构象和原蛋白晶体结构中构象的重叠度。通常认为均方根偏差（RMSD）在2Å范围内。

2 结果与分析

2.1 分子对接参数的确定

通过多次分子对接计算以达到满足参数合理性的要求，确定了各受体蛋白对接晶格中心（x =24.667 nm，y = 6.99 nm，z = -31.485 nm），对接空间（Grid Box）：30 nm × 30 nm × 30 nm，能量范围为4。

2.2 分子对接的结果

化合物（配体）与靶点蛋白5CQG 对接后得到126组结合能数值，均选择第一行（即dist from rmsdl.b.值和best mode rmsdu.b.值均为0）的打分值。由图1 可见，126 个化合物与5CQG 的结合能与结构有明显的相关性。其中酚酸类化合物（1～48）的结合能范围是-8.4～-5.6 kcal/mol；苯丙素（木脂素）类化合物（49～97）的结合能相对集中，范围是-8.8～-6.4 kcal/mol，其中三个结构类似的酰胺类木脂素sar⁃gentodognans F2（85）、sargentodognans F（86）和sar⁃gentodognansG（87）的结合能是该类化合物中最高的，均为-8.7 kcal/mol；三萜及其他类化合物（98～126）的结合能范围是-9.5～-5.5 kcal/mol，其中6 个化合物的结合能绝对值大于9 kcal/mol。黄酮类化合物（2R）-maesopsin-6-O-β-D-glucoside（111）和大黄素类化合物（113～117）具有较高的结合能。其中最高的是大黄酚（114），结合能为-9.5 kcal/mol，但仍弱于原配体BIBR153的-10.9 kcal/mol（表1）。

图1 5CQG与126个化合物的结合能散点图Fig. 1 Scatter plot on affinity scores of 5CQG docking with compounds

表1 5CQG与17个化合物的结合能（绝对值≥8. 5 kcal/mol）Table 1 Affinity scores of 5CQG docking with 17 compounds（Absolute value ≥8. 5 kcal/mol）

以化合物111 和114 为代表进一步分析对接的效果。3D 图显示化合物111和114的分子刚好卡在蛋白5CQG 的凹槽内（图2A 和2B）；进一步分析其2D 图，可见大黄酚与氨基酸残基MET483 形成范德华力；蒽醌环与TYR551、PHE494 形成Pi-Pi 键，与ILE550 形成Pi-Alkyl 键，与ARG486 形成Pi-Cation键，与MET482 形成Pi-Sulfur 键；甲基分别与TYR551、LEU554、MET482、ILE497、PHE494 形 成Akyl 键，与PHE478 形成Pi-Alkyl 键（图2D）。化合物111 与残基TRP498、ILE497、MET483、ARG486、ASP556 和SER560 形成范德华力；黄酮A 环与LEU554 形成Pi-Alkyl 键；B 环与ILE550 形成Pi-Al⁃kyl键，与PHE494、TYR551形成Pi-Pi键，与MET482形 成Pi-sulfur 键；2-OH 与ILE550，糖6-OH 与ARG561，糖环中O 与ARG557 皆形成氢键，但糖6-OH 的H 与ARG557 之间存在斥力；糖的端 基C 与GLY553 之间有碳氢作用（图2C）。这两个化合物与周围的氨基酸残基结合紧密，存在着明显的作用力，有助于与TERT的结合。

图2 5CQG与化合物111（A，C）和114（B，D）的分子对接图Fig. 2 5CQG docking digram with compounds 111（A，C），114（B，D）

3 讨论

前期研究发现红藤乙醇提取物的水溶性部位具有较好的激活端粒酶活性（数据未发表）。为了全面检测红藤中潜在的激活端粒酶的化学成分，我们检索了已经报道的红藤化合物成分，最终确定了126 种小分子化合物，其中包括红藤挥发油中含量超过10% 的δ-荜澄茄烯（122）和α-杜松醇（123）两种化合物［13］。这些化合物以酚酸、苯乙醇类、苯丙酸类及木脂素类化合物居多，而三萜类、黄酮类和醌类化合物含量较少［2］。

据报道，大黄酚、大黄素等化合物具有良好的抗衰老活性［14］，这一点与本次的分子对接结果一致。在后续的药理研究中，将进一步验证本次对接中结合能最高的大黄酚、大黄素等化合物的端粒酶调节活性。分子对接环节的分值较高，只说明化合物与TERT 的结合力较强，但不能确定是激活剂还是抑制剂，这需要药理试验加以验证。

考虑到红藤水溶性部位的主要成分应该是较大极性化合物，因此推断其激活端粒酶的有效物质可能是红藤中的含量丰富且极性较大的酚苷、苯丙素（如：绿原酸）等成分。这一推测与本次对接部分结果一致，一些苯丙素类化合物与蛋白5CQG 确有较高的结合能力，其中对香豆酸-4-O-β-D-葡萄糖苷（51）、绿原酸（59）、丹酚酸B（70）的结合能均为-8.5 kcal/mol（图1）。这也与药理活性研究结果一致：绿原酸能够显著延缓秀丽隐杆线虫的衰老，并增强其抗氧化能力［15］；丹酚酸B 通过抗氧化和保护线粒体DNA，对D-半乳糖致衰老小鼠具有良好的对抗作用［16］；化合物51的苷元部分香豆酸亦具有良好的抗氧化和神经保护活性［17］。后续的试验中也会采用多种生物模型考察这些苯丙素类化合物的抗衰老活性和端粒酶调节机制。但酚苷类化合物与蛋白5CQG 的对接值普遍较低，均未超过-8.5 kcal/mol，这与上述推测不尽一致，这可能与该类分子体积较小，在分子对接过程中，不能与所处位置的氨基酸残基有较强的结合有一定的关系。