超高效液相色谱法测定浓缩饲料中维生素K3含量的不确定度评定

毕融冰 赵 卉 王玉方 孙紫薇 金美伶 刘继永

(中国农业科学院特产研究所， 长春 130000)

测量不确定度(measurement uncertainty，MU)，简称不确定度，是根据所用到的信息，表征赋予被测量值分散性得的非负参数[1]。不确定度一般由若干分量组成，其中一些分量可以根据一系列测量值的统计分布进行评定(A类测量不确定度)；另一些分量则可以根据经验或其它信息获得的概率密度函数进行评定(B类测量不确定度)[2]。通过比较测定过程中各分量引入的相对标准不确定度，并对产生不确定度的主要来源进行分析，可以找出对检测结果产生较大影响的因素并加以控制[3-5]。

维生素K为肝脏合成酶的必须物质，并参与骨骼素的合成，防止畜禽体质软弱、皮下出血，对动物生长发育起着重要的作用，适当补充维生素K，可以避免维生素K缺乏症，因此被广泛用作饲料添加剂。《饲料添加剂品种目录(2013)》[6]收录了亚硫酸氢钠甲萘醌(MSB)、亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌(MNB)、二甲基嘧啶醇亚硫酸甲萘醌(MPB)三种维生素K3类饲料添加剂，三者均以甲萘醌为官能团[7]。目前饲料中维生素A、D3、E和B2的不确定度研究已见报道[5,8-10],张艳红等[5]利用HPLC法对预混合饲料中维生素A、维生素D3和维生素E的测定进行不确定度评定，结果表明：采用最小二乘法求得样品质量浓度的过程和标准溶液配置过程中引入的不确定度贡献较大；陈枫等[10]利用HPLC法对预混合饲料中维生素B2的测定进行不确定度评定，结果表明：重复性实验和标准溶液曲线拟合中引入的不确定度贡献较大；而饲料中维生素K3的不确定度研究较少，本文依据国家标准GB/T18872-2017和JJF1059.1-2012国家计量技术规范，建立数学模型，对UPLC法测定浓缩饲料中维生素K3的含量进行不确定度的评定，以期找出对测量结果影响较大的因素，为浓缩饲料中维生素K3的质量控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三氯甲烷、无水碳酸钠、无水硫酸钠、硅藻土(均为分析纯)；甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；甲萘醌标准品(98.08 %，德国Dr.Ehrenstorfer)；试验用水均为一级水；浓缩饲料(随机选取市售浓缩饲料)。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪(Acquity UPLC H-Class，美国Waters公司)，配有二极管阵列(PDA)检测器；Mettler-Toledo MS204S 电子天平(d=0.0001 g)，Mettler-Toledo XS205电子天平(d=0.00001 g)；高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；氮吹仪(上海安谱实验科技股份有限公司)；调速多用振荡器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1标准溶液的制备

称取甲萘醌标准品25 mg(精确至0.00001 g)于50 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，混匀，为甲萘醌标准储备液，-18 ℃保存。准确吸取0.50 mL甲萘醌标准储备液于50 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，混匀，为甲萘醌标准工作液，工作液浓度约为5 μg·mL-1，-18 ℃保存。

1.3.2试样溶液的制备

浓缩饲料过60目筛，混匀，称取5 g(精确至0.0001 g)于100 mL具塞锥形瓶中，准确加入50 mL三氯甲烷，放在调速多用振荡器上振荡2 min；加入5 mL 1 mol·L-1碳酸钠溶液，振荡3 min；加入5 g硅藻土和无水硫酸钠混合物(3:20，g/g)，振荡30 min；5000 r·min-1，离心10 min。

依据预实验确定分取量，准确吸取20 mL三氯甲烷提取液，氮气吹干，甲醇溶解，定容至5 mL棕色容量瓶中，通过0.22 μm有机系滤膜，用于UPLC分析。

1.3.3色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18反相色谱柱(2.1×100 mm，1.7 μm美国Waters公司)；流动相：甲醇-水(75∶25，V/V)；柱温：室温；流速：0.4 mL·min-1，检测波长：251 nm；进样量：3 μL。

1.3.4定量测定

依次注入相应的甲萘醌标准工作液和试样溶液，根据色谱峰面积的响应值，用外标法定量测定。

2 测量不确定度的评定

2.1 数学模型

维生素K3的含量计算：

(1)

式(1)中：X为浓缩饲料中甲萘醌的含量，mg·kg-1；A1为浓缩饲料试样溶液峰面积值；V1为提取液总体积，mL；V3为定容体积，mL；ρ为甲萘醌标准工作液浓度，μg·mL-1；A0为甲萘醌标准工作液峰面积值；m为浓缩饲料质量，g；V2为提取液分取体积，mL。

2.2 不确定度来源分析

浓缩饲料中维生素K3含量测定的不确定度来源如图1所示。

图1 浓缩饲料中维生素K3含量测定的不确定度来源

由图1，对浓缩饲料中维生素K3含量测定结果有影响的各种不确定度分量来源进行分析，主要有：标准物质产生的不确定度，包括标准物质本身、标准物质称量、配制标准储备液和标准工作液所产生的不确定度；试样溶液产生的不确定度，包括试样称量、试样溶液制备过程所产生的不确定度；样品处理操作过程的差异，即回收率产生的不确定度；仪器测量重复性产生的不确定度，包括试样溶液峰面积和标准品峰面积产生的不确定度。

2.3 不确定度分量的评定

2.3.1标准物质产生的不确定度

标准物质产生的不确定度包括标准物质、标准物质称量、配制标准储备液和标准工作液产生的不确定度，属于B类不确定度。

2.3.1.1标准物质引入的不确定度

甲萘醌标准品由德国Dr.Ehrenstorfer公司生产，由标准物质证书可知其扩展不确定度为0.56 %(k=2)，纯度为98.08 %，则相对标准不确定度为：

2.3.1.2标准物质称量引入的不确定度

相对标准不确定度为：

2.3.1.3标准储备液和标准工作液配制过程中引入的不确定度

称取甲萘醌标准品于50 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，混匀，为标准储备液；使用0.5 mL分度吸量管准确吸取0.5 mL标准储备液于50 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，混匀，得到浓度为5 μg·mL-1甲萘醌标准工作液。

表1 标准储备液和标准工作液配制过程产生的不确定度

则由标准储备液和标准工作液配制过程产生的相对标准不确定度为：

=0.0186

由上述不确定度分量可以得到甲萘醌标准物质产生的相对标准不确定度：

2.3.2试样溶液产生的不确定度

试样溶液产生的不确定度包括试样称量、试样溶液制备过程产生的不确定度，属于B类不确定度。

2.3.2.1试样称量产生的不确定度

相对标准不确定度为：

2.3.2.2试样溶液制备过程产生的不确定度

称取5 g试样于100 mL具塞锥形瓶中，用50 mL单标线吸量管准确加入50 mL三氯甲烷，振荡2 min；用5 mL分度吸量管加入5 mL碳酸钠溶液，振荡3 min；5000 r/min，离心10 min。用20 mL单标线吸量管准确吸取20 mL提取液，氮气吹干，甲醇溶解，定容至5 mL棕色容量瓶中，备用。

表2 试样溶液制备过程产生的不确定度

则试样溶液制备过程产生的相对标准不确定度为：

=0.00773

由上述不确定度分量可以得到试样溶液制备过程产生的相对标准不确定度：

2.3.3仪器重复测量产生的不确定度

2.3.3.1标准品峰面积(A0)重复测量产生的不确定度

则标准品峰面积(A0)重复测量产生的相对标准不确定度为：

2.3.3.2试样溶液峰面积(A1)重复测量产生的不确定度

则试样溶液峰面积(A1)重复测量产生的相对标准不确定度为：

由计算公式计算试样溶液中维生素K3的含量：

2.3.4试样中添加回收率产生的不确定度

则试样中添加回收率产生的相对标准不确定度为：

用t检验法来考察回收率R与1之间是否具有显著性差异:

t值大于双侧临界值t(95，5)=2.571，则回收率R与1之间具有显著性差异，需要回收率R校正测定结果，则试样溶液中维生素K3的含量为：

2.4 合成相对不确定度和扩展不确定度的计算

各分量的相对标准不确定度见表3。

表3 各分量的相对标准不确定度

则合成相对不确定度为：

取包含因子k=2(置信水平为95%)，则测得试样溶液中维生素K3的相对扩展不确定度为：

U(X)=k·urel(X)=2×0.0233=0.0466

2.5 结果报告

经回收率R校正,试样溶液中维生素K3的含量为1.42 mg·kg-1，则其扩展不确定度为：

U=U(X)·X=0.0466×1.42=0.07mg·kg-1

故本试验浓缩饲料中维生素K3的UPLC法测定结果为：1.42±0.07mg·kg-1，k=2(95%置信度)。

3 分析

由图2可知，UPLC测定浓缩饲料中维生素K3含量的过程中对不确定度影响最小的是urel(A0)，其次是urel(R)、urel(s)和urel(A1)，urel(r)是影响本次试验结果的主要来源，由图3可知，标准物质产生的不确定度分量中，urel(Vr)是主要影响因素。

图3 标准物质各分量产生的相对标准不确定度

综上，配制标准储备液和工作液过程中，适当增大分取体积，使用经过检定/校准合格的量器，避免实验操作过程中实验室温度波动过大，可以减小由标准物质引入的不确定度。实验涉及的重要仪器设备应定期检定/校准和维护，保证仪器设备状态，降低由仪器设备引入的不确定度。通过避光操作，减小实验过程中甲萘醌遇光分解产生的损失，减小添加回收率产生的不确定度。通过以上实验操作，来减小各分量产生的不确定度，进而达到提高检测结果准确性和可靠性的目的，为浓缩饲料中维生素K3的质量控制提供理论依据。