赶黄草总黄酮类化合物的提取纯化工艺研究

王雪飞，许 颖，信 悦，李文娣，吴 健(1.哈尔滨商业大学 药物工程技术研究中心，哈尔滨 150076；2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨 150076)

赶黄草是赤水河流域的天然草本科植物，其果实部分极少，大部分都是茎和叶，对于赶黄草相关的诸多记载中，明代朱肃的《救荒本草》是对赶黄草记录最早的[1].赶黄草虽然在世界分布广，但目前主要的种植地区在四川等地，再就是有且仅有在中国，将赶黄草应用为药用植物.赶黄草不仅属于当地正宗的中药材，而且还具有悠久的食用历史[2].由于赶黄草的药理作用丰富且有效成份以及活性物质繁多，逐渐的引起了世界范围科学家的兴趣.赶黄草的去除黄疸的功效也与名字有关，这是因为民间传闻赶黄草对黄疸性肝炎有奇特的作用[3].赶黄草是一种广泛存于民间的用于治疗和预防各种肝病的有效药物，根据历史记录和现代研究，赶黄草也被编录到各种药物典籍当中，在古代治疗方法中常用来治病救人，故而有着“神仙草”[4]的美称.赶黄草的研究及其发展过程中依旧存在些难以解决的问题，主要是一些研究深度与技术发展的问题，解决方案应根据实际情况分析，目前的解决方法主要是制度的完善、质量标准的把控以及深入加强基础研究和其他领域的发展，投入更多精力与时间.据相关文献表明，赶黄草药效作用具有广泛临床意义，但有关本实验的相关研究课题尚未全面[5-6].在目前赶黄草的所有研究中，均只有针对其保肝作用黄酮类化学成份进行研究[7]，然而对赶黄草的其他化学成分的分析研究不足，并缺乏一定的准确性和系统性.

黄酮类化合物的提取方法有很多，实验主要针对回流和超声两种提取方法，通过正交试验对其工艺进行优化[8-10]，采用聚酰胺树脂对总黄酮的纯化实验条件进行筛选[11-12]，为日后赶黄草总黄酮类化合物提取以及富集纯化等实验研究提供数据依据.

1 实验仪器与材料

RE-52AA型旋转蒸发仪(亚荣生化仪器厂)；Cintra10型紫外分光光度仪(UV8100, 莱伯泰科仪器有限公司)；数显恒温水浴锅(金城国胜实验仪器厂)；JP-030ST超声清洗机(洁盟清洁设备有限公司).

赶黄草(四川泸州古蔺地区)；聚酰胺( 上海源叶生物公司) ；无水乙醇(中药集团试剂有限公司)；芦丁(RS03951020，诗丹德生物有限公司)；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠(金山化学试剂有限公司).

赶黄草采购于四川泸州市古蔺县，经哈尔滨商业大学陈宁副研究员鉴定为虎耳草科扯根菜属植物赶黄草.

2 赶黄草总黄酮的提取实验

2.1 试验方法

2.1.1 芦丁标准曲线及回归方程的建立

称取芦丁标准品2.5 mg，用60%的乙醇配成质量浓度为0.1 mg/mL的标准品溶液.

移液枪精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL溶液分别放入6只10 mL的容量瓶中，加入60%乙醇使溶液体积达到5.0 mL，加入5%NaNO2溶液0.3 mL摇匀后静置5 min；再加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL摇匀后静置5 min，再加入1.0 mol/LNaOH溶液4.0 mL混匀，最后用60%乙醇定容到10 mL，放置15 min后各组溶液以0.0 mL溶液为空白对照在波长510 nm处分别测得各溶液吸光度.

2.1.2 单因素实验

1)料液比

称取3份赶黄草粗粉各5 g，根据料液比(1∶10、1∶15、1∶20)加入不同体积的60%乙醇溶液于蒸馏烧瓶中，待80 ℃恒温水浴条件稳定后，连接提取实验器材，提取1 h.经赶黄草三次平行提取实验，将提取液旋转蒸发后，再定容，打开紫外分光光度仪，510 nm处测定提取液吸光度(以下实验均设此数值测定)，对三次测定结果取平均值，整理后绘图.如图1可知最佳条件的料液比为1∶15.

图1 料液比

2)乙醇体积分数

依据1)实验条件下乙醇体积分数分别为50%、60%、70%的乙醇溶液，对三次测定结果取平均值，整理后绘图.如图2可知最佳条件的乙醇体积分数为60%.

图2 乙醇体积分数

3)提取时间

依据1)实验条件下提取不同时间分别为0.5、1、1.5 h提取.三次测定结果取平均值整理后绘图.如图3可知最佳提取时间为1 h.

图3 提取时间

4)提取温度

依据1)实验条件下提取温度为40、60、80 ℃，温度稳定后连接回流提取装置.三次测定结果取平均值整理后绘图.如图4可知最佳提取温度为80 ℃.

图4 提取温度

2.1.3 回流提取正交试验

据单因素实验，建立赶黄草回流提取正交试验因素及水平，见表1.

表1 回流提取正交试验因素与水平表

2.1.4 超声提取法与正交试验

通过查阅文献以及赶黄草的超声预实验,建立正交试验表，超声法选定乙醇体积分数(A)、超声提取时间(B)、料液比(C)、温度(D)等进行试验,多次定容测定吸光度，取一组计算化合物中含黄酮的量.

根据最佳提取条件和正交试验表，实验每次获得三次煎煮液，合并，分别定容乙醇水溶液，料液比分别为1∶20、1∶25、1∶30，测得吸光度，填入表中进行对比.超声提取正交试验因素和水平，见表2.

表2 超声提取正交试验因素与水平表

2.2 实验结果

2.2.1 芦丁标准曲线及回归方程的建立

各组以0.0 mL溶液为空白对照，在510 nm处测得各溶液吸光度，以吸光度(A)为纵坐标，质量浓度(C)为横坐标绘制标准曲线如图5.

最后得出回归方程式：A=13.289C(C为芦丁标准液质量浓度mg/mL；A为吸光度值；相关系数R2=0.997 3)，

图5 芦丁标准曲线

2.2.2 回流提取的正交试验

据表1设立正交试验，记录数据.结果见表3，方差分析见表4.

对表3进行数据分析，R的大小顺序反应了实验因素的影响程度，四种因素对赶黄草的含黄酮量有不同的影响.据表4分析，在方差影响因素从大到小排序；料液比、提取温度、乙醇体积数、回流时间.在顺序中，排在前面两种影响因素，具有显著影响.

表3 回流提取正交试验结果表

表4 回流方差分析表

综合以上正交试验数据可知，最终得到的赶黄草黄酮类化合物最优回流提取条件以及影响因素的大小，其条件为；料液比、提取温度为、乙醇体积分数、提取时间四种因素各为1∶15、60℃、60%、1 h.

2.2.3 超声提取的正交试验

根据表2，建立正交试验.结果如下:超声正交试验见表5，方差分析见表6.

表5 超声提取正交试验结果表

表6 超声方差分析表

对表5进行数据分析，据以上实验原理，影响因素从大到小为：料液比、提取温度、乙醇体积分数和超声时间.据表6分析，在超声方差影响因素排序，从大到小为：乙醇体积分数、提取时间、料液比和提取温度.最佳超声提取条件分别为60%，50 min，1∶25和50 ℃.

综上所述,回流法为总黄酮提取的最佳工艺.本实验采用乙醇，其溶剂是对人体无害的提取剂，利用合适的含乙醇量水溶液能够有效地提高药材中的有效成分的溶解度.

在本次实验研究中，比较了赶黄草总黄酮提取的两种实验，旨在简化工艺，提高提取效率，为今后的赶黄草黄酮类化合物的研究提供基础数据.

3 赶黄草总黄酮纯化工艺研究

3.1 聚酰胺的预处理

称取一定量的聚酰胺，放入洁净干燥的柱子中，称量定量蒸馏水加入柱中浸泡12 h后，放出蒸馏水计算保留体积，用4～7倍保留体积的无水乙醇冲柱，无水乙醇冲洗后用蒸馏水冲洗至柱中无醇味，后用上述相同体积的5%NaOH溶液冲柱，NaOH溶液冲洗后用蒸馏水冲洗至中性，再用体积分数为10%CH3COOH溶液冲柱，分数为用蒸馏水冲洗至中性，冲洗后可直接使用或烘干备用.

3.2 干法上样

称取赶黄草干浸膏用蒸馏水溶解后，少量多次的拌入一定比例的聚酰胺树脂中，直至浸膏溶液完全吸附于聚酰胺上，保证拌样后聚酰胺为干燥状态，将拌样后的聚酰胺均匀撒在聚酰胺柱上层后继续均匀撒少许聚酰胺作为保护层，加压赶走柱中气泡，平铺一层棉花覆盖聚酰胺，加入沸石压在棉花上层进行稳固.

3.3 实验方法

3.3.1 聚酰胺的静态吸附

称取30～60目、60～80目、80～100目聚酰胺树脂各15 g，放入250 mL锥形瓶中，称取干浸膏1 g加水溶解后转移至100 mL容量瓶中定容.定容后转移至锥形瓶中，放入空气浴振荡器中震荡10 h.取上清液按照标准曲线测定溶液中含黄酮量，代入吸附率公式计中计算总黄酮在三种不同规格的聚酰胺中的静态吸附率.

吸附率(%)=(MW-C1×V1)/MW×100%

其中：V1为锥形瓶中上清液的体积(mL)，C1为上清液总黄酮质量浓度(mg/mL)，M为赶黄草干浸膏质量(mg)，W为浸膏中的总黄酮的百分含量(%).

3.3.2 聚酰胺的动态吸附与解吸

称取30～60目、60～80目、80～100目聚酰胺树脂各15 g，测得保留体积约30 mL，干法上柱，依据3.3.1方法配制浸膏溶液，拌样3 g聚酰胺树脂，120 mL蒸馏水以自然流速冲洗，取3 mL洗脱液根据标准曲线计算洗脱出的水溶液中总黄酮质量浓度，代入吸附率公式中计算聚酰胺的动态吸附率.

水洗脱后采用70%的乙醇210 mL继续以自然流速冲洗，取3 mL洗脱液根据标准曲线计算洗脱出的水溶液中总黄酮质量浓度，代入解析率公式中计算总黄酮在不同规格聚酰胺中的动态解析率.

解析率(%)=(MW-C1×V1)/MW×100%

其中：V1为锥形瓶中上清液的体积(mL)，C1为上清液总黄酮质量浓度(mg/mL)，M为赶黄草干浸膏质量(mg)，W为浸膏中的总黄酮的百分含量(%).

3.3.3 溶液pH值的选择

称取五组预处理的聚酰胺各15 g，分别加入250 mL锥形瓶中，依据3.3.1方法，分别用pH值1、2、3、4、5的水溶解配制浸膏溶液，称取3 g聚酰胺拌样，加入锥形瓶中，放入空气浴振荡器中震荡1.5 h.取上清液3 mL按照标准曲线测定溶液中含总黄酮量，代入吸附率公式计算不同质量浓度的聚酰胺静态吸附率.

3.3.4 装柱比例的选择

依据3.3.1方法配制浸膏溶液，后拌样3 g聚酰胺树脂，按照1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的比例精密称取预处理后的聚酰胺5、10、15、20、25 g，用7倍保留体积的蒸馏水过柱冲洗，收集流分测定吸光度，按照标准曲线测定溶液中含总黄酮量.

3.3.5 拌样比例的选择

称取预处理后的聚酰胺15 g五组，加入定量蒸馏水浸泡12 h，计算聚酰胺保留体积约30 mL，依据3.3.1方法配制浸膏溶液，分别按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5拌样聚酰胺，晾干后装柱，分别量取210 mL蒸馏水冲洗聚酰胺柱，收集流分测定吸光度，按照标准曲线测定溶液中含总黄酮量.

3.3.6 洗脱溶剂pH值的选择

称取预处理后的聚酰胺15 g五组分别装柱，称取五份1 g赶黄草干浸膏，依据3.3.1方法配制浸膏溶液拌样3 g聚酰胺，晾干上柱，再用210 mL的pH值为4、6、8、10、12的70%乙醇冲洗，每30 mL收集洗脱液，测定洗脱液的吸光度并按照标准曲线测定溶液中含总黄酮量，代入解析率公式中计算动态解析率.

3.3.7 乙醇体积分数及用量的选择

称取预处理后的聚酰胺15 g五组分别装柱，称取五份1 g赶黄草干浸膏用蒸馏水溶解后分别拌样3 g聚酰胺，晾干上柱，再用210 mL的不同体积分数的乙醇冲洗，乙醇体积分数分别为10%、30%、50%、70%、90%，每30 mL收集一次洗脱液，测定吸光度并按照标准曲线测定溶液中含总黄酮量，代入解析率公式中计算动态解析率.

3.4 实验结果

3.4.1 聚酰胺的静态吸附

三种规格的聚酰胺对总黄酮的静态吸附率分别为82.66%、91.08%、88.35%，结果如图6.

图6 不同规格聚酰胺吸附率

3.4.2 聚酰胺的动态吸附与解吸

三种规格的聚酰胺吸附率分别为78.26%、82.34%、80.15%，结果表明60～80目聚酰胺对总黄酮的吸附率最高.

计算总黄酮在不同规格聚酰胺中的动态解析率的结果分别为72.92%、79.47%、70.53%.根据静态吸附实验与动态吸附实验的结果显示，最终选择的吸附剂为60～80目的聚酰胺树脂.结果如图7、8.

图7 不同规格聚酰胺吸附率

图8 不同规格聚酰胺解析率

3.4.3 溶液pH值的选择

测定上清液的吸光度，依据标准曲线测定溶液中含总黄酮量，代入吸附率公式中计算静态吸附率，根据计算结果得出溶液pH值为4时的聚酰胺吸附效果最好. 见图9.

图9 不同溶液pH值吸附率结果

3.4.4 装柱比例的选择

测定洗脱液的吸光度，按照标准曲线测定溶液中含总黄酮量，根据计算结果得出拌样比例为1∶3时聚酰胺吸附总黄酮最好.结果如图10.

3.4.5 拌样比例的选择

测定洗脱液吸光度，按照标准曲线测定溶液中含总黄酮量，根据计算结果得出拌样比例为1∶3时聚酰胺吸附总黄酮最好.结果如图11.

图11 不同拌样比例吸附率结果

3.4.6 洗脱溶剂pH值的选择

测定洗脱液的吸光度并按照标准曲线测定溶液中含总黄酮量，代入解析率公式中计算动态解析率，根据计算结果选择pH值为8的洗脱剂对赶黄草总黄酮进行洗脱，结果如图12.

图12 不同pH值的洗脱液吸附率结果

3.4.7 乙醇体积分数及用量的选择

根据解析率公式计算动态解析率的结果选择70%的乙醇体积分数对赶黄草总黄酮进行洗脱，并且当洗脱剂用量为3倍保留体积时总黄酮的动态解析率最大，因此洗脱剂用量需要大于3倍量保留体积，结果如图13.

图13 不同乙醇体积分数及不同洗脱体积对总黄酮解析率结果

3.5 验证试验

称取3组预处理后的聚酰胺(60～80目)15 g，将其分别装柱.称取3份1 g赶黄草干浸膏用pH值为4的蒸馏水溶解后分别拌样3 g聚酰胺，晾干后装入洁净干燥的柱中，再用pH值为8的70%体积分数乙醇冲洗210 mL，在60 mL乙醇洗脱后开始收集流分，测定其吸光度并按照标准曲线测定溶液中含总黄酮量，代入解析率公式中计算动态解析率，根据所得结果取平均值为68.82%，RSD值为0.29%，并且纯化后的赶黄草浸膏中含总黄酮量增加了14.74%，说明聚酰胺树脂纯化赶黄草中的含总黄酮量稳定有效.

4 结 语

通过本实验最终确定了回流提取赶黄草中总黄酮的最佳条件以及影响因素：料液比>提取温度为>乙醇体积分数>提取时间，四种因素各为1∶15、60 ℃、60%、1 h.在顺序中，排在前面两种影响因素具有显著影响.超声提取方法的结果表明：乙醇的体积分数>提取时间>料液比>提取温度，各因素分别为60%，50 min，1∶25和50 ℃.而聚酰胺纯化黄酮实验的结果是：60～80目聚酰胺树脂、溶液pH值为4、装柱比例1∶15、拌样比例1∶3、洗脱溶剂pH值为8、乙醇体积分数为70%并且用量大于3倍保留体积.

本次实验研究不仅进行对两种提取方法进行了条件优化，而且对于聚酰胺纯化的条件也进行了筛选，为以后的相关实验提供基础依据.