贵州省高原水体浮游动物对抗生素的富集特征

向 刚，袁 萌，党安志，龙胜兴

（1.贵州师范大学地理与环境科学学院，贵阳 550001；2.贵州省交通科学研究院股份有限公司，贵阳 550008；3.贵州省环境科学研究设计院，贵阳 550081）

抗生素被广泛用于人类预防及治疗各种疾病，中国每年使用抗生素总量超过21万t［1］，特别是抗生素被广泛应用于水产养殖鱼类、虾类等水产品的疾病预防，或添加在饲料中用于提高饲料利用率和促进鱼类、虾类等动物生长［2］。有研究表明，网箱养殖过程中大量的抗生素以及含有抗生素的消毒剂被用于网箱及鱼体消毒和直接添加到饲料中［3］。如磺胺类药物（Sulfonamides，简称Sas）是一类具有抗菌谱广、疗效强、方便安全、价格低廉等优点的抗生素，在水产养殖中被广泛应用［4］。抗生素进入动物体内后有40%～90%会以母体或代谢物的形式随尿液和粪便排出体外进入环境［5，6］。进入水环境中的抗生素被浮游植物吸收蓄积，通过浮游动物、鱼类食物链进入人体，破坏人体造血系统或致癌，进而引起一系列的人类健康问题［7］。

水产养殖不仅使水体中残留大量的抗生素污染物，而且还加剧了水体富营养化进程，主要原因是由于水产养殖过程中投放大量未被鱼类或虾类摄食消化，且氮、磷的含量较高的饲料；同时，高密度水产养殖的鱼类、虾类排泄物也可加剧水体富营养化。有研究表明，1994年贵州省红枫湖、百花湖水库网箱养殖投放的饵料，其含氮率为4.5%，含磷率为7.0%，饵料的利用率为40%～80%，说明饵料有20%～60%氮、磷沉积水库中，饲料成为水体富营养化的重要污染物来源［8］。Pan等［1］研究发现浮游动物Daphnia magna的死亡率随诺氟沙星浓度的提高而增加。Zalewski等［9］研究表明，水体中微生物的生物量随水体中抗生素含量的增加而减少，肉食性浮游动物种类明显随水体中的抗生素含量增加而转变为植食性的浮游动物种类。Sanderson等［10］对226种抗生素进行研究发现，有80%的抗生素对浮游植物有明显的促进生长和繁殖作用，抗生素对浮游动物致死浓度为0.1～1.0 mg/L的比例为60%。显然，水体中抗生素对浮游生物的生长和繁殖以及浮游动物食性、致死性都有明显的影响。本研究调查了贵州省红枫湖水库、百花湖水库、阿哈水库、草海湿地水体中的浮游动物对抗生素污染物的富集特征，并结合水体中的环境理化因子，初步探讨贵州省高原深水水库及典型湿地水体中的浮游动物对抗生素的富集影响，以期为水质控制及生态环境保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域

研究地红枫湖水库（红枫湖）、百花水库（百花湖）为位于贵州省中部、乌江支流猫跳河上的两座梯级水库，是贵阳市生活和生产的重要水源。红枫湖流域面积1 596.0 km2，水面面积57.2 km2，最大水深45.00 m，平均水深10.51 m，百花湖水域面积14.5 km2。红枫湖与百花湖简称两湖，其功能主要是发电、调洪、供水、农灌，1994年未发生死鱼事件前，还有养殖功能，现仅有供人居饮用作用。1960年以来，其所在的流域内有电力、化工、化肥、机械、建材、煤炭等大中小型及骨干企业约27家。建库40多年来，其周边的工业、农业、生活污水通过各种渠道排入两湖，1997—1998年发现红枫湖总氮最高值达4.06 mg/L，总磷为1.68 mg/L，百花湖总氮最高为5.34 mg/L，总磷为1.16 mg/L，1999—2002年红枫湖和百花湖的总氮变化不明显，最高值仍然在4.00 mg/L以上，而总磷明显下降，最高值为0.40 mg/L［11］。2012年以后，红枫湖、百花湖总氮平均值分别为1.50、1.70 mg/L，总磷平均值分别为0.07、0.03 mg/L［12］。

阿哈水库（26°30′—26°33′N，106°03′—106°39′E）位于贵阳市南明河支流小车河上，于1960年建成，有效库容4.45×107m3，是以城市供水和防洪为主要功能的中型水库。阿哈上游主要补给水区内的游鱼河久安乡、麦坪乡以及林东矿务局的煤矿密集区等区域，共计分布有300多个煤矿，其开采过程中的矿坑废水经雨水冲刷进入水库中，使其水中的硫酸根浓度高达303.08 mg/L［11］。

草海位于贵州省西部威宁县境内，是该省内最大的天然淡水湖，海拔2 171.7 m，是一个典型的高原湿地生态系统，草海湖盆面积45 km2，湖底海拔2 170 m。

根据研究区域的地理环境特征，分别在红枫湖水库、百花湖水库、阿哈水库、草海湿地共设置15个采样断面（表1）。

表1 红枫湖水库、百花湖水库、阿哈水库、草海湿地采样断面

1.2 样品采集

于2016年1—8月在红枫湖、百花湖、阿哈水库、草海湿地进行样品采集。阿哈水库、百花湖水库进行4次采样，分别为2016年1、4、6、8月；红枫湖进行2次采样，分别是2016年6、8月；草海湿地进行2次采样，分别是2016年1、4月。

1）水质化学样品的采集。采集混合水样装入100 mL棕色广口瓶中，加入几滴浓硫酸，使pH＜2，用于测定总氮、总磷。同时，采集混合水样1 000 mL装入小口棕色玻璃瓶中，并加入1%的碳酸镁悬浊液1 mL，立即置于4℃的冰盒中运回实验室，用于测定叶绿素a。用于水质化学测定的样品按总数的20%采集平行样，用于质量控制。

2）水体中抗生素的采集。将1 000 mL的硼硅玻璃采样瓶放进马弗炉中烧6 h，冷却备用，用5 L有机玻璃定深采水器分别在红枫湖、百花湖、阿哈水库的表层0.5、6.0 m处，距库底2.0 m处采集水样使其形成混合样，草海湿地水体表层采集5 L水样，分别装入1 000 mL样品瓶中，并加入4 mol/L浓硫酸40μL于水样中酸化保存，所有操作过程均使用一次性聚乙烯手套，置于4℃的冰盒中避光保存，所有样品按20%的比例采集平行样，带回实验室进行预处理。

3）浮游动物体样品中的抗生素采集。将浅水型浮游生物网放入水体中，让采样船稍稍移动，使得浮游生物网顺着水流方向移动，并使浮游生物网下沉至水体下层，但不能使其接触水库或湿地底部的底泥，然后匀速缓慢收回浮游生物网拖绳。将收集的浮游动物转移至放有20 L清水的样品瓶中，反复如此操作，直到被收集的浮游动物湿重在3 g以上，干重可达2.0 g以上。将含有浮游动物的样品瓶静置20 min，使得水体中的颗粒物下沉至样品瓶底部，然后将样品瓶上层的浮游动物转移至另一个样品瓶中，并向样品瓶中加入少量福尔马林试剂使浮游动物死亡并下沉至样品瓶中，再次静置20 min，倒弃样品瓶上层含有浮游植物的水体，用50 mL的EP管收集下沉在样品瓶下层的浮游动物样品，放入冰盒，带回实验室后立即放入-80℃冰箱中冰冻，第二天将浮游动物样品放入-80℃的冷冻干燥机中冻干，储存在干燥器中待测。浮游动物物种鉴定的样品从第一次拖网的浮游生物网中收集，装入30 mL的样品中，并加入4%的福尔马林试剂用于固定浮游动物样品，在显微镜（BXT-90B）下镜检，分类依据沈嘉瑞等［13］、王家楫［14］、蒋燮治等［15］的方法。

1.3 样品分析

水质参数总氮、总磷依据地表水GB3838—2002标准方法测定；总磷采用钼酸铵分光光度法测定；总氮采用碱性过硫酸钾消解-紫外分分光度法测定；叶绿素a采用反复冻融，丙酮浸提法测定［16］。

1）水体中的抗生素样品预处理。用GF/F膜（0.47μm，47 mm，Whatman，UK）过滤，以除去水中的悬浮物，加入交沙霉素、磺胺甲基嘧啶、甲氯环素、喹喏酮类（吡哌酸）各100μg/L作为内标。样品固相萃取时，依次用5 mL（×2）甲醇和5 mL（×2）去离子水来活化固相萃取（SPE）的Oasis HLB小柱（6 mL/500 mg，Waters公司），水样以10 mL/min的速度过小柱。待水样处理完成后，用5%甲醇清洗小柱，以去除与小柱结合的杂质，抽真空干燥2 h，以去除残留的水分。用3 mL（×4）甲醇洗脱小柱上保留的抗生素，洗脱液氮吹至近干，样品重新溶解于1 mL甲醇中，所得溶液过0.22μm有机相滤膜（Waters公司）以去除杂质，保存在2 mL棕色进样瓶（Aileng Technologies，US）中，-18℃保存待测。

2）浮游动物体中抗生素的提取。称取0.50 g左右冻干的浮游动物样品并研磨均匀，置于50 mL的离心管中，加入交沙霉素、磺胺甲基嘧啶、甲氯环素、喹喏酮类（吡哌酸）各100μg/L作为内标，放入冰箱冷藏静置过夜。过夜的浮游动物样品加入萃取剂（0.2 g氯化钠，0.1 g柠檬酸二钠盐1.5水合物，0.2 g柠檬酸三钠），每个样品分别加入0.2 g无水硫酸钠（500℃马弗炉烧4 h），加入提取液（8 mL 1%酸化乙腈：1 mL乙腈，9 mL乙酸），涡旋60 s，加入2 mL酸化乙腈冲洗离心管，10 000 r/min，10℃离心10 min，上清液被转移至另一支干净的50 mL离心管，其残渣加入5 mL酸化乙腈重复以上操作，合并2次上清液。收集的上清液中加入25 mg乙二胺-N-丙基硅烷（PSA粉）去除脂肪，60 mg石墨化碳（GCB）去除色素，80 mg C18去除非极性物质，迅速涡旋60 s，10 000 r/min，10℃离心10 min，上清液被转移至干净的小试管内，35℃水浴下氮气吹至近干，用1 mL甲醇复溶，过0.22μm Nylon膜，置于样品瓶中待测。色谱-质谱条件为高效液相色谱仪HP110LC（Agilent Technologies，US），Agilent ZORBAXSB-C8色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 m）；柱温25℃；进样量5 L，流速为0.3 mL/min。使用梯度洗脱来优化分离，流动相包0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）：88%A（0 min）、65%A（8.0 min）、25%A（11.6 min）、88%A（11.7 min）、88%A（20.0 min）。AB Sciex API4000 Qtrap质谱仪（AB sciex，US），离子源为ESI源正离子模式，气帘气压为172.37 kPa，离子源电压为5 500 V，干燥气温度为500℃，雾化气压为413.69 kPa。

1.4 质量控制与数据分析

质量控制使用的药剂为磺胺甲基嘧啶、磺胺吡啶、磺胺醋酰、磺胺二甲嘧啶、甲氧苄啶、诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、氧氟沙星、氧四环素、四环素、红霉素（脱水），罗红霉素单个标准样品，原始浓度均为1.0 mg/L（Sigma-Aldrich公司）配制成混合标准液100μg/L进行加标回收，标样测定结果的回收率为90%～110%，方法可靠。

数据分析使用Canoco 5.0、Origin 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 环境理化因子

由图1a可知，红枫湖、百花湖、阿哈水库、草海湿地水体的总氮（TN）含量平均值为1.93 mg/L，变化范围为1.23～2.88 mg/L。阿哈水库总氮含量明显最高，平均值为2.59 mg/L；草海湿地相对较低，平均值为1.66 mg/L。

由图1b可知，红枫湖、百花湖、阿哈水库、草海湿地水体的总磷（TP）含量平均值分别为0.031、0.041、0.047、0.027 mg/L，最高值和最低值分别在2016年6月S1采样点（0.063 mg/L）和S8采样点（0.010 mg/L）被检出。

由图1c可知，红枫湖、百花湖、阿哈水库、草海湿地水体中的叶绿素a含量为3.00～24.40 mg/L，最高值出现在2016年4月的S3采样点，最低值在2016年1月的S4采样点，红枫湖、百花湖、阿哈水库、草海湿地水体中的叶绿素a含量平均值分别为7.93、10.22、13.05、8.50 mg/L。

由表2可知，红枫湖及草海湿地水体中的抗生素含量平均值相对较高，其中，罗红霉素的平均含量最高，而磺胺吡啶含量在百花湖的平均值最低。

表2 红枫湖、百花湖、阿哈水库和草海湿地水体中被检出的抗生素平均值 （单位：ng/L）

2.2 浮游动物群落结构

由表3可知，2016年1—8月对红枫湖水库、百花湖水库、阿哈水库及草海湿地采集的浮游动物样品进行分析，浮游动物主要类群有枝角类、桡足类及轮虫类三大类别。2016年1月及4月，百花湖水库与阿哈水库浮游动物种类明显一致。2016年6月，红枫湖、百花湖水库及阿哈水库枝角类主要物种与百花湖水库、阿哈水库4月采集到的物种基本相同，桡足类出现了广布中剑水蚤，轮虫类的前节晶囊轮虫明显增加。2016年8月，红枫湖水库、百花湖水库及阿哈水库水体的浮游动物群落明显发生了变化，其舌状叶镖水蚤变化为主要的优势种。2016年1月及4月草海湿地主要优势种浮游动物枝角类为透明蚤，桡足类为近邻剑水蚤，轮虫类为螺形鬼甲轮虫。

表3 红枫湖、百花湖、阿哈水库和草海湿地浮游动物主要优势种

2.3 浮游动物体中抗生素含量变化特征

红枫湖、百花湖、阿哈水库、草海湿地水体中的浮游动物体中的抗生素检出种类共计27种，磺胺类抗生素种类明显居多，有10种；其次是氟喹诺酮类，有7种；再次是大环内酯，有3种（表4）。

表4 红枫湖、百花湖、阿哈水库、草海湿地水体浮游动物体中的抗生素检出种类

由表5可知，强力霉素（DC）在浮游动物体中的含量仅在2016年1月的百花湖大坝被检出（20.5 ng/g）。氧四环素（OTC）在阿哈水库（S1）、百花湖水库（S3、S5）、红枫湖水库（S10）共计有4次被检出，其含量较高，S3、S5、S10、S1采样点含量分别为954.70、502.14、321.36、53.96 ng/g。磺胺类抗生素在阿哈水库、百花湖水库、红枫湖水库除磺胺二甲异恶唑（SX）检出量（最大值为20.33 ng/g，最小值为2.69 ng/g）相对较高外，其他种类的磺胺类抗生素检出量较低；草海湿地水体中浮游动物磺胺类除磺胺对甲氧嘧啶（SM）（1、4月含量分别5.07、0.44 ng/g）有检出外，暂未发现有其他种类。

浮游动物体中的喹诺酮类抗生素富集种类主要是环丙沙星（CFX）、氧氟沙星（OFX）、罗美沙星（LFX）3个种类，浮游动物体中的环丙沙星、氧氟沙星、罗美沙星含量变化范围分别为3.98～83.56 ng/g、0.43～100.59 ng/g、0.47～264.68 ng/g，平均值分别为20.49、14.67、34.14 ng/g（图2、表5）。对红枫湖、百花湖、阿哈水库及草海湿地理化因子TP、TN与浮游动物体中抗生素含量进行CCA典范对应分析（图3）表明，罗美沙星与TN、TP呈明显的正相关，与氧氟沙星及环丙沙星呈负相关。其他氟喹诺酮类的抗生素，除恩诺氟沙星（EFX）在阿哈水库S2采样点检出含量（111.50 ng/g）较高外，其他的达诺沙星（DAN）、诺氟沙星（NFX）、氟罗沙星（FX）有检出，但检出率较低（表5）。

由图2、图3可以看出，浮游动物体中大环内酯类抗生素主要是脱水红霉素（ETM-H2O），且检出率最高，富集能力最为明显。浮游动物体中脱水红霉素含量最高值出现在2016年6月红枫湖水库西郊水厂，为92.40 ng/g，最低值出现在2016年1月草海湿地上游，为2.70 ng/g，浮游动物体中的脱水红霉素含量明显随水体中的TN、TP及叶绿素a含量的增加而降低，呈负相关。而克拉霉素（CTM）和罗红霉素（RTM）的检出率较低，其中，克拉霉素仅在2016年4月的S6采样点和2016年8月的S7采样点有检出，含量分别为0.48、1.07 ng/g（表5）。

林可霉素（LIN）及盐霉素（SAL）在浮游动物体中的检出率较高，其变化范围分别为1.38～70.48 ng/g、0.54～75.09 ng/g，平均值分别为14.31、14.46 ng/g（图2），其浮游动体中的林可霉素、莫能菌素及盐霉素含量明显随水体中的TN、TP含量的增加而增加，呈正相关（图3），奥美普林、甲氧苄啶也有检出，但含量较低（表5）。

表5 红枫湖、百花湖、阿哈水库、草海湿地水体浮游动物体内抗生素含量（单位：ng/g）

3 讨论

有研究发现，河流水体中污染最严重的抗生素种类主要是磺胺类和四环素类，2009年12月黄浦江地表水中的磺胺甲嘧啶检出浓度为623.3 ng/L，四环素为33.63 ng/L［17］。本研究发现，红枫湖、百花湖、阿哈水库、草海湿地中主要检出的抗生素种类的含量较低，被检出的抗生素含量最高的是罗红霉素，为6.61 ng/L，抗生素含量在河流与湖泊水库或是湿地水体中的分布有明异的性质差异，这种分布特征与水流作用有明显的相关性，河流水体中的抗生素含量高，其主要原因是污染水体中的抗生素随水流不断向前运动；湖泊水库或是湿地水体中的抗生素含量低，其主要原因可能是相对静止的水流有利于水体中抗生素下沉。然而，湖泊水库或湿地水体与河流的差异除了水流外，湖泊水库或湿地水体中的浮游动物现存量较河流高也是有别于河流的主要特征之一，显然，湖泊水库和湿地水体的抗生素在下沉过程中将被其中的大量浮游动物吸收富集，并通过食物链传递进入人体。因此，研究浮游动物体对抗生素的富集，可以了解水体中抗生素在食物链传递过程及抗生素在水生环境中的风险健康。

本研究发现，草海湿地中的浮游动物体内的各种抗生素含量明显低于红枫湖、百花湖和阿哈水库，其主要原因是草海湿地水体中分布有大量的水生植物，如菹草（Potamogeton crispusL.）、狐尾藻（Myrio phyllum verticillatumL.）、菖蒲（Acorus calamusL.）、眼子菜（Potamogeton distinctusA.Benn.）、黑藻［Hydril la verticillata（Linn.f.）Royle］等能富集和吸收大量抗生素污染物的植物，而个体较小的浮游动物富集和吸收的抗生素污染物自然就降低了。有研究表明，水生植物菹草、狐尾藻、菖蒲、眼子菜、黑藻对抗生素污染物有较强的吸收富集能力，它们对喹诺酮类富集总浓度分别可达1183.9、389.3、198.1、1 449.2、1 166.0μg/kg，对四环素富集总浓度分别可达595.0、1 173.9、0、555.9、14.4μg/kg［18］。显然，本研究发现红枫湖、百花湖和阿哈水库浮游动物体内抗生素含量高于草海湿地，这与其水体中生长有大量的水生植物明显相关。朱琳等［18］曾报道水体中鲫鱼体内及植物对磺胺类抗生素富集含量较低，与本研究结论相似。本研究也发现，浮游动物体内的磺胺类抗生素含量检出率明显较低，且含量也较其他类别抗生素含量低。然而，底栖动物体内的磺胺类抗生素含量较高，Won等［19］研究表明，生活在水体底层的鳝鱼体内的磺胺甲恶唑抗生素含量最高，达5 104 ng/g，这一结果表明，底栖生物体比较容易富集或是吸收磺胺类抗生素污染物，相反，水体中的磺胺类不易被浮游动物富集或吸收，其主要原因可能是沉降在底泥中的磺胺类抗生素被底栖动物大量摄食引起，已有研究表明，底泥中的磺胺类抗生素含量明显高于水体中，且其吸附能力强于水体［20］。此外，本研究发现，红枫湖、百花湖和阿哈水库中喹诺酮类的环丙沙星、氧氟沙星、罗美沙星和诺氟沙星以及大环内酯类的脱水红霉素容易被其水库中的浮游动物大量吸收。有研究发现，氟喹诺酮、环丙沙星等抗生素没有明显的生物降解现象发生［21］。因此，本研究初步认为，浮游动物对喹诺酮类和大环内酯显著富集也可能与其生物降解能力较低有关。另一个原因可能与水体污染源有关，有研究表明，喹诺酮类和大环内酯类抗生素在医院污水、养殖污水中的质量浓度较高，其中大环内酯最高可达100 mg/L［22］，红枫湖、百花湖和阿哈水库曾在20世纪90年代进行过大规模养殖产业，显然，过去的养殖业水体中的抗生素残留是引起其水库中浮游动物体内抗生素含量较高的因素之一。

不同的季节，红枫湖、百花湖和阿哈水库水体中的抗生素在浮游动物体中的富集差异明显，本研究表明，3个水库中的浮游动物群落可能是引起其抗生素富集差异的主要原因，2016年6月，3个水库中枝角类物种角突网纹溞被检出，而广布中剑水蚤有消退现象，轮虫类主要优势种也由1月的螺形鬼甲轮虫转变为多肢轮虫、前节晶囊轮虫，浮游植物类群也开始检出大量的盘星藻属以及角甲藻物种。

通过典范对应相关性分析表明，罗美沙星与TN、TP呈明显的正相关，与氧氟沙星及环丙沙星呈负相关，浮游动物体中的脱水红霉素含量明显随水体中的TN、TP及叶绿素a含量的增加而降低，浮游动物体中的林可霉素、莫能菌素及盐霉素含量明显随水体中TN、TP含量的增加而增加。本研究认为，水体中的TN、TP及叶绿素a含量能引起抗生素在浮游动物体中的增加与降低，其主要原因可能是TN、TP及叶绿素a含量变化影响水环境中抗生素降解机制而导致。有研究表明，四环素在水环境中的光解行为会随着水样中的pH增大、NO3-N浓度的增加而提高光解速率［23］，Ryan等［24］研究也发现氧氟沙星在水体中的降解主要是光降解，其光降解率为48%。显然，TN、TP的增加同样可能提高水体中氧氟沙星的光解率，使得水体中的浮游动物吸收并富集较低浓度的氧氟沙星。

4 小结

1）高原水体环境中的TN、TP及叶绿素a含量是影响浮游动物体对抗生素富集的重要因子，其原因是TN、TP及叶绿素a含量降低了水体中抗生素的光降解效率。

2）草海湿地环境中丰富的水生植被群落结构特征是影响浮游动物对水环境抗生素富集的主要因子，其主要原因是湿地水体中的高现存量的植被能较强地吸附其水环境中的抗生素污染物。

3）不同季节浮游动物对抗生素污染物的富集有明显差异，其主要是由浮游动物群落季节交替而引起。