吕梁黑山羊成纤维细胞培养过程中支原体污染的快速发现及去除

吴苏君，李 希，王 曦

(山西农业大学动物科学学院，山西 太原 030032)

细胞体外增殖技术被称为细胞培养，广泛应用于科研、教学、临床试验、制备生物制品等领域，其中污染控制是关键。能导致细胞污染的微生物很多，最为常见的是支原体[1]。由于缺乏细胞壁的支撑，支原体可变形通过0.22 μm滤膜，常用抗生素如青霉素和链霉素对其去除效果不佳[2]。世界范围内使用中的细胞系支原体污染发生率为30%～60%[3-5]，国内来源的细胞株系支原体污染发生率高达60%[6]。支原体污染初期，细胞形态变化不甚明显，支原体滴度随时间延长逐渐升高，最高可达109个/mL。污染发生后期，支原体改变细胞DNA/RNA及蛋白的表达，导致其变形、死亡[7]。因此，在污染初期尽快进行支原体检测、去除尤为重要。目前检测及去除支原体污染的方法很多。吕梁黑山羊作为山西省地方优良品种，具有珍贵的生物种用价值[8]。本试验采取吕梁黑山羊耳缘组织培养成纤维细胞，结合运用高倍显微镜直接观察法和DNA荧光染色法，快速发现细胞培养过程中的支原体污染，利用支原体抗生素Plasmocin将其去除，检测去除效果，进而构建稳定的细胞培养体系，为后续探究吕梁黑山羊种质资源的利用提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 吕梁黑山羊(0～3月龄)耳缘组织，采自山西省农业科学院畜牧兽医研究所克隆基地试验羊场；胎牛血清FBS，购自Hyclone公司；DMEM，购自Gibco公司；DPBS、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、Hoechst 33342，均购自Sigma公司；PlasmocinTMtreatment，购自InvivoGen公司；细胞cDNA提取试剂盒、DL2 000 DNA Marker，均购自TIANGEN公司；RT-PCR试剂盒，购自TaKaRa公司；……