不同浓度6-BA和ZT诱导芍药离体叶片愈伤组织的效果

赵 敏

(徐州生物工程职业技术学院， 江苏 徐州 221006)

芍药(PaeonialactifloraPall.)是芍药亚科(Subfam. Paeonioideae)芍药属(Paeonia)落叶亚灌木，不仅是供观赏的经济植物，还有很高的药用价值。近年来，因为连续栽种芍药导致土壤中积累很多有致病威胁的病菌，对芍药的产量构成极大威胁。目前芍药的繁殖方法有播种、嫁接、分株、扦插、压条等方式，分株和播种是常使用的繁殖方法，采用分株繁殖的方法操作简便，可行性高，但是成活率低；播种方法培育的后代容易发生变异，不能将亲本的优良性状进行有效保留[1]。植物组织培养技术是植物培育研究中的基本实验技术和研究手段，具有繁殖系数较高、周期短，可很好保留母株的优良性状等有诸多优势，在对植株脱毒、选育新品种、快速繁殖、人工培育种子和植物药用成分生产中得到广泛应用，为植物基因工程创造了前提条件[2]。在组织培养条件中，最重要的是植物生长调节剂的种类和浓度，目前使用最多的生长素有 2，4-D、NAA、IAA、IBA等，而6-BA、TDZ、KT、ZT 这些植物激素是最常用的细胞分裂素，采用2种及以上生长素与分裂素互相搭配使用，对促进愈伤组织诱导、增殖及不定芽的分化有更好的效果。但芍药的组织培养技术研究还处于基础研究阶段，研究内容主要在选择外植体和培养基配方方面，少部分研究培育出了生长出根的植株，需要对芍药的扩繁育苗体系进行更深入的研究。为此，笔者于2021年4月22日对芍药外植体选择与处理、愈伤培养基选择、组培中存在的褐化问题进行研究，以期对利用组培技术进行芍药离体繁殖提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

芍药的植物组织采自徐州生物工程职业技术学院农林系的芍药试验花田。选择生长旺盛、枝繁叶茂、枝干粗壮的健康芍药，采取生长旺盛、无病虫害的植株叶片作为供试材料。

1.2 试验设计

选取在芍药、牡丹器官培养运用较最为广泛的MS培养基，以 1/2 MS +2，4-D 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L为基本培养基，pH 5.8。在基本培养基中添加不同浓度的 6-BA(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)或ZT(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)，共设置7个不同配比处理(表1)，每个配比重复3瓶，每个瓶内接种4个处理好的无菌外植体。培养条件：温度25℃、湿度60%、光周期12 h/d。

表1 芍药离体叶片愈伤组织诱导培养基的激素组合

将芍药离体叶片的愈伤组织转移到继代培养基中，定期观察愈伤组织是否出现褐化现象。继代培养基以 1/2MS 作为基本培养基，加入不同浓度的2，4-D、NAA、6-BA、ZT，组合成7个不同浓度配比(表2)。

表2 芍药离体叶片愈伤组织继代培养基的激素组合

1.3 试验方法

于9月选取长势良好的芍药植株摘取顶部新生嫩叶，将芍药叶片放入培养皿中，覆盖细密纱布，用自来水冲洗1.5 h，擦干水分后将叶片放入超净工作台，彻底消毒灭菌，将外植体表面存在的微生物彻底灭活以避免产生菌斑影响试验结果，同时要求对外植体组织和表层细胞的伤害降至最低。先用75%酒精进行消毒，持续30 s，用无菌水冲洗3～5次，再用0.1%氯化汞消毒5 min，再使用无菌水冲洗 3～5次，消毒过程重复3次，最后再使用无菌水冲洗3～5次，在超净工作台将叶片切成 5 mm×5 mm小块进行诱导培养[3]。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织的诱导效果

从表3看出，芍药离体叶片愈伤诱导率最高为A-4，达83.3%，诱导出离体叶片愈伤组织的速度最快，为26 d，且诱导的愈伤组织体积大、长势好，在3～4 d出现褐化；A-3、A-6诱导离体叶片愈伤组织的效果次之，诱导率分别为66.7%、58.3%，诱导出愈伤组织的时间分别为27 d、29 d，且诱导出的愈伤组织在4～5 d出现褐化；A-2、A-5、A-7诱导离体叶片愈伤组织的效果较差，诱导率分别为25.0%、41.7%、50.0%，诱导出愈伤组织的时间分别为30 d、31 d、32 d，在3～5 d出现不同程度褐化。总体而言，使用6-BA和ZT具有细胞分裂活性的分裂素都能够有效诱导生长点的分化，且6-BA的效果比ZT好，最佳离体叶片诱导愈伤组织培养基的配方为1/2 MS +2，4-D 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+LH 0.5 g/L+6-BA 1.5 mg/L。

表3 不同培养基对芍药愈伤组织的诱导效果

2.2 愈伤组织的继代培养效果

芍药是一种多年生草本植物，次生代谢比较旺盛，而且植株内还含有很多自身合成的酚类化合物，因此在组织培养过程中外植体很容易发生褐化。从表4看出，B-7诱导出愈伤组织到褐化的时间最长，达117 d，说明B-7培养基能够有效抑制酚类物质的产生和延缓愈伤组织发生褐化的时间，这对于芍药愈伤组织的继代培养十分有利。因此，在芍药愈伤继代培养中应选用B-7号培养基。

表4 不同浓度激素对芍药愈伤组织的继代培养效果

3 小结

用1/2 MS作为基本培养基，添加不同浓度6-BA或ZT，对芍药离体叶片愈伤组织进行培养，结果表明，6-BA和ZT具有细胞分裂活性的分裂素都能够有效诱导生长点的分化，且6-BA的效果比ZT好，当 6-BA浓度为 1.5 mg/L时芍药离体叶片愈伤组织的诱导效果最好(诱导率83.3%)，即最适诱导培养基为1/2 MS +2，4-D 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+LH 0.5 g/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 7 g/L+6-BA 1.5 mg/L；最适继代培养基为1/2 MS 0.1 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+6-BA 1.5 mg/L。

在试验操作中芍药愈伤组织易被污染，培养基、超净工作台及容器等器具在前期一定要做到彻底消毒、规范操作等。芍药组织培养一般难生根，这也是芍药组织培养快速繁殖技术难以应用于生产的原因。芍药离体组织快速繁殖技术在理论上已经被证实具有可行性，但与实际生产试验中有较大差距，主要是继代时间、激素类型、生根方法等多因素会影响到诱导生根，还存在过高的外植体褐化率、很低的不定芽增殖率等较多问题。因此，芍药离体组织快速繁殖技术还需要进一步深入研究，以建立高效率且稳定的植株再生及离体快繁技术体系。