miR-34a靶向MMP2对TNF-α诱导人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo迁移及侵袭的影响

温彦静，彭青△，王静娜，李曼，常美英

子痫前期（preeclampsia，PE）为一种妊娠期特发性疾病，是造成孕产妇死亡的主要原因之一［1］。滋养层细胞迁移和侵袭能力下降引起子宫螺旋动脉重铸障碍是PE 发病的原因之一［2］。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类锌依赖性蛋白酶，为血管和子宫重塑的重要调节剂，血管MMP2的减少可能导致血管舒张减弱，收缩增强，引起妊娠高血压和PE［3］。微小RNA（miRNA）的异常表达与人类多种疾病的发生有关，人类胎盘组织中miRNA的异常表达可能导致胎盘功能障碍或PE等疾病［4］。miR-34a 能够调控多种基因的表达，与多种癌细胞的增殖、侵袭和迁移有关［5-7］，是公认的抑癌基因。Xue等［8］研究表明，PE患者血清miR-34a-5p表达水平显著高于健康孕妇。miR-34a 能够通过靶向MMP2 抑制神经胶质瘤细胞LN229 及U251 的迁移和侵袭［9］。人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo来源于早孕期滋养层细胞，常被用于滋养层细胞的生物学活性研究。本研究通过肿瘤坏死因子（TNF）-α刺激人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo，体外模拟PE的炎性环境，探讨miR-34a能否通过与MMP2结合，影响滋养层细胞侵袭和迁移，从而参与PE的发展。

1 材料与方法

1.1 材料 人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo（CN-10079）购自上海弘顺生物科技有限公司。TNF-α（SRP3177）购自美国Sigma公司；胎牛血清（G20228）、DMEM培养基（G17115）、胰蛋白酶（G10231）均购自美国Gibco 公司；Lipofectamine 3000 试剂盒（L3000-050）购自美国 Invitrogen 公司；RNAiso Plus试剂盒（RK-0057）、反转录试剂盒（RK-0311）、荧光定量PCR试剂盒（RA-1075）购自日本TAKARA公司；CCK-8细胞计数试剂盒（P5119）、蛋白提取试剂盒（SF60013）、BCA 蛋白定量试剂盒（SK10078）、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（A0208）购自上海碧云天生物技术有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（YT128）购自北京百奥莱博科技有限公司；兔抗人MMP2单克隆抗体（40994）、兔抗人β-actin单克隆抗体（4970）购自美国 Cell Signaling Technology 公司；miR-34a、MMP2、U6、GAPDH 引物以及miR-34a mimics、miR-34a mimics阴性对照、miR-34a inhibitor、miR-34a inhibitor阴性对照由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；MCO-5AC 型CO2培养箱购自日本三洋公司；AE2000型倒置显微镜购自北京汗盟紫星仪器仪表有限公司；QuantStudio 3型实时荧光定量PCR（qPCR）仪购自美国ABI 公司；ELx808 型酶标仪购自深圳市瑞士宝特贸易有限公司；ZF-388 型蛋白凝胶成像仪购自上海嘉鹏科技有限公司。

1.2 细胞培养 对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo 进行常规复苏，转移至含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养。每2～3 d更换1次培养液，细胞生长良好且达到对数期时进行后续实验。

1.2.1 TNF-α 刺激人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo 取对数期的HTR-8/SVneo 细胞，0.25%胰蛋白酶消化，接种细胞至6孔板中，调整细胞数目为1×105个/孔，加入不含胎牛血清的DMEM 完全培养基，于37 ℃、5%CO2饱和湿度的恒温培养箱中进行培养。细胞融合度达到80%时，分别设置TNF-α诱导组（将培养液换为含0.5 μg/L TNF-α的DMEM完全培养基）和对照组（仅更换正常新鲜培养液）［10］。

1.2.2 细胞转染及分组 取1.2.1中TNF-α刺激的人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo 接种至6孔板中，调整细胞数目为6×105个/孔。细胞融合度达到60%时，弃去6孔板中培养基，加入含0.5 μg/L TNF-α的新鲜培养基，利用Lipofectamine 3000进行转染，操作严格按照说明书进行。将细胞分为对照组（细胞不做任何处理，正常培养条件进行培养）、miR-34a mimics组（转染miR-34a mimics）、NC 组（转染miR-34a mimics 阴性对照）、miR-34a inhibitor 组（转染miR-34a inhibitor）、iNC 组（转染miR-34a inhibitor阴性对照）和TNF-α诱导组（未经转染的细胞）。转染48 h后，倒置显微镜观察各组细胞转染情况。

1.2.3 qPCR 检测各组细胞 miR-34a、MMP2 mRNA 的表达水平 按照RNAiso Plus试剂盒说明书提取1.2.2中各组细胞总RNA，按照反转录试剂盒说明书将提取的RNA 反转录成cDNA，之后进行qPCR 反应，反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共40 个循环。miR-34a 以 U6 作为内参基因，MMP2 以 GAPDH 作为内参基因，采用2-ΔΔCt方法计算各组细胞中miR-34a、MMP2 mRNA相对表达量。引物序列见表1。

Tab.1 Primer sequences表1 引物序列

1.2.4 CCK-8 法检测各组细胞增殖情况 取1.2.2 中各组对数期细胞，0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞密度为5×105个/mL，每孔 100 μL 加至 96 孔板中，每组设置 6 个复孔，于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h，加入10 μL CCK-8 试剂，37 ℃避光培养2 h，弃上清，酶标仪450 nm 波长处检测每孔光密度（OD）值，细胞增殖抑制率=［（对照组OD 值-实验组OD 值）/对照组OD值］×100%。

1.2.5 Transwell 侵袭实验检测各组细胞侵袭能力 取1.2.2中各组对数期细胞，0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞密度为5×105个/mL。吸取 100 μL 细胞悬液加至铺有 Matrigel 胶的Transwell小室上室，Transwell下室加入600 μL含胎牛血清的DMEM完全培养基，于37 ℃培养24 h，倒掉上室培养液，用棉签轻轻擦去Matrigel胶及未迁移细胞，无水甲醇固定30 min，0.1%结晶紫溶液染色20 min，显微镜下随机读取5个视野对染色细胞进行计数，计算平均值。

1.2.6 划痕实验检测各组细胞迁移能力 取1.2.2 中各组对数期细胞接种至6孔板中，37 ℃、5%CO2，饱和湿度的恒温培养箱中培养，细胞长满视野时进行后续实验。黑色马克笔于6 孔板板后划线，利用灭菌的20 μL 枪头在孔板上垂直于划线进行划痕，划好后冲洗残余悬浮液。孔内加入不含胎牛血清的DEME 培养基，37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养。分别于0、24 h 后显微镜下取点，观察并拍照。以0 h 时初始距离（D0h）为对比，测量24 h 时距离（D24h），计算细胞迁移率。迁移率（%）=（D0h-D24h）/D0h×100%。

1.2.7 蛋白免疫印迹法检测MMP2 蛋白表达水平 取1.2.2中各组细胞，调整密度为5×105个/mL，每孔100 μL加至96孔板中，培养 24 h 后，弃上清，PBS 洗涤 2 次，重悬细胞，利用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定提取总蛋白浓度，蛋白样品进行SDS-PAGE，电泳结束后将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉遮光封闭2 h。分别加入兔抗人MMP2、β-actin 一抗稀释液（均为1∶1 000 稀释），4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（1∶2 000），室温孵育1 h，TBST 洗膜3次，蛋白凝胶成像仪分析MMP2蛋白表达水平。

1.2.8 双荧光素酶报告系统分析 通过Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）数据库预测人MMP2 基因3′UTR含有与miR-34a的结合位点。对含结合位点的MMP2区段进行扩增，并插入到pcDNA 载体上，构建pcDNAMMP2-3′UTR-WT 质粒；以此质粒对结合片段进行定点（Del：55539387-55539393）突 变 ，构 建 pcDNA-MMP2-3′UTR-Del 质粒。pcDNA-MMP2-3′UTR-WT 质粒、pcDNAMMP2-3′UTR-Del 质粒分别与miR-34a NC、miR-34a mimics共转染到人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo 中，每组设置3个重复，转染6 h 后，更换培养基。质粒共转染48 h 后，弃去培养基，PBS 洗涤细胞；每孔加入50 μL 1×PLB 裂解缓冲液，震荡，使细胞全部裂解；在不透光96孔酶标板中每孔加上述上清液10 μL，加入100 μL 双荧光素酶反应试剂Ⅱ，检测萤火虫荧光素酶反应强度，测定结束后加100 μL Stop&Glo，检测内参海肾荧光素酶反应强度。荧光素酶相对活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0 软件对数据进行分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞miR-34a及MMP2 mRNA的表达 与对照组比较，TNF-α诱导组细胞miR-34a表达升高，MMP2 mRNA 表达降低（P＜0.05）；与TNF-α 诱导组和NC组比较，miR-34a mimics 组细胞miR-34a表达升高，MMP2 mRNA表达降低（P＜0.05）；与TNF-α诱导组和iNC组比较，miR-34a inhibitor组细胞miR-34a表达降低，MMP2 mRNA表达升高（P＜0.05）。见表2。

Tab.2 Comparison of expression levels of miR-34a and MMP2 mRNA between the six groups表2 各组细胞miR-34a及MMP2 mRNA表达水平比较（n=3，）

Tab.2 Comparison of expression levels of miR-34a and MMP2 mRNA between the six groups表2 各组细胞miR-34a及MMP2 mRNA表达水平比较（n=3，）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与TNF-α 诱导组比较，c与NC 组比较，d与iNC组比较，P＜0.05

组别对照组TNF-α诱导组NC组miR-34a mimics组iNC组miR-34a inhibitor组F miR-34a 1.01±0.03 1.58±0.06a 1.55±0.05 3.93±0.04bc 1.52±0.03 0.44±0.04bd 2 290.913＊＊MMP2 mRNA 0.99±0.03 0.54±0.05a 0.53±0.07 0.32±0.04bc 0.55±0.06 0.87±0.05bd 67.943＊＊

2.2 miR-34a 对TNF-α 刺激下人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo 增殖的影响 对照组、TNF-α 诱导组、NC 组、miR-34a mimics 组、iNC 组、miR-34a inhibitor 组 细 胞 增 殖 抑 制 率 分 别 为 0、（54.37±2.06）% 、（52.75±2.19）% 、（78.93±2.67）% 、（55.29±1.86）% 和（19.16±2.18）%（n=6，F=1 208.115，P＜0.01）。与对照组比较，TNF-α诱导组细胞增殖抑制率升高（P＜0.05）；与TNF-α 诱导组和NC 组比较，miR-34a mimics 组细胞增殖抑制率升高（P＜0.05）；与TNF-α诱导组和iNC组比较，miR-34a inhibitor组细胞增殖抑制率降低（P＜0.05）。

2.3 miR-34a 对TNF-α 刺激下人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo 侵袭和迁移的影响 与对照组比较，TNF-α诱导组细胞侵袭数目和迁移率降低（P＜0.05）；与 TNF-α 诱导组和 NC 组比较，miR-34a mimics组细胞侵袭数目和迁移率降低（P＜0.05）；与TNF-α诱导组和iNC组比较，miR-34a inhibitor 组细胞侵袭数目和迁移率升高（P＜0.05），见表3，图1、2。

Tab.3 Comparison of cell invasion number and migration rate between the six groups表3 各组细胞侵袭数目和迁移率的比较 （n=3，）

Tab.3 Comparison of cell invasion number and migration rate between the six groups表3 各组细胞侵袭数目和迁移率的比较 （n=3，）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与TNF-α 诱导组比较，c与NC 组比较，d与iNC组比较，P＜0.05

迁移率（%）26.73±2.51 15.46±3.24a 14.59±3.16 6.25±2.18bc 14.34±2.29 23.48±3.57bd 19.413＊＊组别对照组TNF-α诱导组NC组miR-34a mimics组iNC组miR-34a inhibitor组F细胞侵袭数目（个）248.32±12.37 123.37±11.26a 126.58±12.35 84.61±11.54bc 117.38±13.65 178.45±14.22bd 64.118＊＊

Fig.1 Effects of miR-34a on cell invasion(crystal violet dyeing,×400)图1 miR-34a对细胞侵袭的影响（结晶紫染色，×400）

2.4 miR-34a 对TNF-α 刺激下人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo 中MMP2 蛋白表达的影响 对照组、TNF-α 诱导组、NC 组、miR-34a mimics 组、iNC组、miR-34a inhibitor 组MMP2 蛋白表达分别为1.29±0.13、0.83±0.11、0.85±0.13、0.44±0.14、0.81±0.09、1.16±0.15（n=3，F=16.587，P＜0.01）；与对照组比较，TNF-α 诱导组细胞MMP2 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与TNF-α 诱导组和NC 组比较，miR-34a mimics 组细胞MMP2 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与TNF-α诱导组和iNC组比较，miR-34a inhibitor组细胞MMP2蛋白表达水平升高（P＜0.05）。见图3。

Fig.3 Effects of miR-34a on MMP2 protein expression in each group图3 miR-34a对各组细胞中MMP2蛋白表达的影响

2.5 miR-34a 对MMP2 基因的靶向调节 Starbase数据库预测结果表明，MMP2 基因 3′UTR 区含有与miR-34a 结合位点，位于miR-34a 3′UTR 55539387-55539393 区 域 ，见 图 4。 miR-34a NC-pcDNAMMP2-3′UTR-WT 组 、miR-34a mimics-pcDNAMMP2-3′UTR-WT 组、miR-34a NC-pcDNA-MMP2-3′UTR-Del 组 、miR-34a mimics-pcDNA-MMP2-3′UTR-Del 组荧光素酶相对活性分别为2.35±0.02、1.19±0.02、2.32±0.04、2.29±0.05（n=3，F=745.474，P＜0.01）；与 miR-34a NC-pcDNA-MMP2-3′UTRWT 组 比 较 ，miR-34a mimics-pcDNA-MMP2-3′UTR-WT 组荧光素酶相对活性显著降低（P＜0.05）。

Fig.4 Starbase database predicted that miR-34a had binding sites with MMP2图4 Starbase数据库预测miR-34a与MMP2具有结合位点

3 讨论

PE是围产期导致母婴死亡的主要疾病之一［11］，终止妊娠是唯一有效的治疗方法。目前PE 的发病机制尚不清楚，子宫螺旋动脉重铸障碍和滋养层细胞分化缺陷被认为是引起PE 的关键因素［12］。滋养层细胞侵袭和迁移能力下降是引起螺旋动脉血管重铸障碍的主要原因。因此，研究与滋养层细胞侵袭和迁移有关的因素，可能有助于进一步解析PE的发生机制。高水平TNF-α与妊娠高血压及PE、妊娠糖尿病等多种妊娠疾病有关［13］。体外实验表明，TNF-α刺激人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo后能够抑制其迁移和侵袭［14］。本研究利用TNF-α 刺激人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo 体外模拟炎症环境，发现TNF-α 刺激人绒毛膜滋养层细胞后miR-34a表达水平、细胞增殖抑制率均显著高于对照组，MMP2 mRNA 和蛋白表达水平及细胞迁移率和侵袭数目均显著低于对照组，说明miR-34a、MMP2 可能与细胞的侵袭和迁移有关。

miR-34a 是一个公认的抑癌基因。研究表明miR-34a过表达能够抑制结肠癌细胞HCT116、膀胱癌细胞HT-1197、HT-1376的增殖、侵袭和迁移［5，15］。滋养层细胞侵入子宫内膜的穿透性与侵袭性肿瘤相似，Liu 等［16］研究表明 PE 患者胎盘组织和细胞中miR-34a 表达水平显著高于健康孕妇，且miR-34a通过Notch信号通路抑制PE患者胎盘滋养层细胞的侵袭。本研究结果表明，miR-34a 显著抑制TNF-α刺激导致的人绒毛膜滋养层细胞的侵袭和迁移，而抑制miR-34a表达，则情况相反，说明miR-34a过表达可抑制胚胎滋养层细胞的侵袭和迁移。

滋养层细胞是胎盘组织的重要细胞，其能够通过侵袭和迁移穿透母胎界面，促使胎盘形成，维持正常胎盘功能，胎盘重塑和滋养层细胞侵袭螺旋动脉可为胎儿提供充足的血液和营养［17-18］。MMP2 在侵袭性绒毛外滋养层细胞中大量表达，与滋养层细胞的侵袭性高度相关，能够在妊娠期间发挥子宫内膜组织重塑的作用［3］。Jin等［19］研究表明抑制MMP2表达能够抑制人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo的侵袭和迁移，参与PE 的发生。本研究结果表明，与TNF-α 诱导组比较，miR-34a 过表达能够降低细胞中MMP2 mRNA 及蛋白的表达，而抑制miR-34a 的表达能够增加MMP2 mRNA及蛋白的表达。生物信息学网站预测结果表明MMP2的3′UTR序列含有与miR-34a结合的位点，说明miR-34a与MMP2之间可能存在靶向关系。Yang 等［20］研究表明 miR-34a 通过靶向抑制MMP2的表达抑制食管癌细胞的侵袭和迁移。本研究双荧光素酶实验进一步证明miR-34a mimics-pcDNA-MMP2-3′UTR-WT 组荧光素酶相对活性显著低于miR-34a NC-pcDNA-MMP2-3′UTRWT 组，提示 miR-34a 抑制 MMP2 的表达。miR-34a可能通过靶向抑制MMP2 的表达，降低滋养层细胞的侵袭性，导致子宫螺旋动脉重铸障碍，进而参与妊娠高血压及PE等疾病的发生。

综上所述，miR-34a 可能通过靶向抑制MMP2的表达抑制人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo的侵袭和迁移，进而导致PE的发生。本研究仅从体外细胞模拟实验分析了miR-34a 及MMP2 对PE 的影响，还需结合临床研究进一步证明miR-34a 靶向调节MMP2在PE发病中的机制。