基于网络药理学探讨当归补血汤治疗化疗所致心肌损伤的机制

刘兰椿，刘 超，毛启远，王 阶

化疗是治疗肿瘤的常用手段，但临床化疗药物存在较大的毒副作用，其中以严重的心脏毒性常见，若病变发生在心肌，病人预后极差，死亡率达48%[1]。化疗后出现的心脏毒性临床表现多样，轻者无症状，仅出现缺血性心电图改变，重者发生心肌坏死、致死性充血性心力衰竭[2]。现阶段常用的化疗药物中引起心肌损伤的有柔红霉素、阿霉素及表阿霉素等，但关于化疗药物造成的心肌损伤机制尚不明确，虽有氧化应激学说、钙超载及能量代谢障碍学说，但针对两种假说研发的西药右丙亚胺、磷酸肌酸等存在对化疗病人的总体无进展生存期影响不大、远期生存率无明显差异的问题[3-4]，导致临床许多恶性肿瘤病人最终死于严重的心血管并发症，而非肿瘤本身，故发生机制与防治手段是目前心血管专家与肿瘤专家共同面临的难题。

化疗药物的副作用属于药毒范畴，从中医学分析，药毒是强烈的致病因素，药毒致病最易伤人正气，病情复杂而凶险，病程漫长且顽固难治[5]。当归补血汤是补气生血的经典名方，始载于《内外伤辨惑论》，由黄芪、当归按5∶1组成。方中重用黄芪益气托毒，为君药；当归养血和营，为臣药；当归补血汤具有补气养血托毒之功效，临床应用以气血虚弱、阳气浮越、脉洪大而虚、重按无力为辨证要点，有研究显示，当归补血汤具有保护缺血心肌、促进血管生成等作用[6]。当归补血汤具有免疫调节作用，可增强机体细胞免疫和体液免疫，恢复化疗引起的免疫功能低下[7]。尽管药理学证明当归补血汤具有抗肿瘤和保护心血管的作用，但具体机制尚不明确。本研究基于网络药理学探讨当归补血汤治疗化疗所致心肌损伤的可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 筛选有效成分及靶基因 检索中药系统药理学技术平台(TCMSP)数据库[8]得到当归补血汤中“当归”“黄芪”的“ingredients”活性成分，之后基于文献报道纳入生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.05的有效成分，此时贴近当归-黄芪药对的药理学和药代动力学特征[9]。最终纳入“related targets”中相应靶点，并根据Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)查询靶点蛋白对应的基因名称。

1.2 获取当归补血汤治疗心肌损伤的靶基因 在人类基因数据库(GeneCards)、人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、治疗靶点数据库(TTD)、药物数据库(DrugBank)中检索心肌损伤的关键词“myocardial injury”，下载疾病基因文件，之后将当归、黄芪靶基因分别与疾病基因进行映射，与疾病基因取并集，得到当归补血汤组方干预心肌损伤的可能靶基因，并绘制Venn图。

1.3 构建药物-成分-靶点-疾病网络 将当归补血汤治疗心肌损伤的靶基因与OB≥30%和DL≥0.05筛选出的当归补血汤活性成分映射，创建包含“疾病-靶点”“药物-靶点”“药物-成分”的“network”文件及描述节点类型的“type”文件，将两个文件导入CytoScape 3.7.2软件绘制活性成分-靶点-疾病交互网络图。网络中的节点(node)代表当归、黄芪活性成分、关键靶基因及心肌损伤疾病；边(edge)代表上述节点之间的相互作用关系。

1.4 构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络 利用STRING整合预测PPI，可视化展示PPI网络功能[10]。选择“multiple proteins”输入关键靶基因，对“Homo sapiens”进行检索，选择高等置信度为0.950，下载PPI关系图及tsv文件，并筛选居前30位核心基因。

1.5 靶基因基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析 在R软件(Version 3.6.1)安装Bioconductor软件包“org.Hs.eg.db”并运行，将当归补血汤治疗心肌损伤的关键靶基因转换成entrezID。之后在R软件安装“clusterProfiler”和“DOSE”包，根据已转换的entrezID，以P<0.05，Q<0.05进行关键靶基因GO与KEGG功能富集分析，并将结果以条形图和气泡图形式输出。

2 结 果

2.1 当归补血汤有效成分及靶基因 在TCMSP数据库中检索当归、黄芪两味药的所有有效成分(截至2020年1月)，结果显示当归活性成分共125个、黄芪活性成分共87个。根据OB≥30%和DL≥0.05筛选出当归活性成分27个、黄芪活性成分32个，共59个活性成分。选择“related targets”获得当归靶点272个、黄芪靶点435个，药物靶点共707个。

2.2 治疗心肌损伤的相关基因 通过GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank获得2 943个心肌损伤相关基因，与272个当归、435个黄芪的靶基因去重后进行映射，共得到157个当归补血汤治疗心肌损伤的靶基因(与绿色相交部分)，其中得到黄芪治疗心肌损伤的可能靶基因154个，当归治疗心肌损伤的可能靶基因40个。详见图1。

图1 当归补血汤治疗心肌损伤相关靶基因Venn图

2.3 药物-成分-靶点-疾病网络构建 将157个心肌损伤治疗相关靶基因分别与27个当归活性成分、32个黄芪活性成分进行映射，建立当归补血汤活性成分与靶基因的联系，同时得到治疗心肌损伤的24个当归成分、23个黄芪成分，共涉及有效成分47个，详见表1。将包含“疾病-靶点”“药物-靶点”“药物-成分”的“network”文件和描述节点类型的“type”文件导入到CytoScape 3.7.2中，建立“药物-成分-靶点-疾病”网络，紫色三角代表当归的24个有效成分，红色箭头代表黄芪的23个有效成分，黄色椭圆代表154个相关靶基因。详见图2。

表1 当归补血汤治疗心肌损伤的活性成分及OB、DL

图2 药物-成分-靶点-疾病网络(紫色三角代表当归有效成分，红色箭头代表黄芪有效成分，黄色椭圆代表靶基因)

2.4 PPI网络构建 将关键靶基因输入到STRING中，选择高等置信度0.950，下载PPI及tsv文件，得到109个基因的PPI网络，根据R语言的计算结果，其中转录因子AP-1(JUN)、丝氨酸/苏氨酸激酶1(Akt1)、白细胞介素6(IL6)、核转录因子(NF)-κB p65亚基(RELA)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)居前5位。详见图3、图4。

图3 PPI核心基因

图4 中药-疾病关键靶点(degree值，居前30位)

2.5 关键靶基因GO功能富集 通过关键靶基因，共富集124个生物学过程和功能，根据校正后P值进行排序，选择前30个进行条形图展示，详见图5。当归补血汤有效成分主要参与肾上腺素受体活性、类固醇激素受体活性、G蛋白偶联的胺受体活性、核受体活性、转录因子活性、儿茶酚胺结合、细胞因子受体结合、细胞因子活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、DNA结合转录激活剂活性、磷酸酶结合、激酶调节活性、血红素结合、蛋白磷酸酶结合等生物过程，进而发挥对心肌损伤的治疗作用。

图5 关键靶基因GO功能富集分析

2.6 关键靶基因KEGG功能富集 对关键靶基因与KEGG进行映射，共富集163条通路，根据校正后P值进行排序，选择前30个进行气泡图展示，详见图6。当归补血汤有效成分主要参与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、MAPK、白细胞介素17、肿瘤坏死因子(TNF)、缺氧诱导因子1(HIF-1)等相关信号通路。其中PI3K/Akt信号通路作为自噬关键通路在心肌损伤中起到重要作用。

图6 关键靶基因KEGG功能富集分析

3 讨 论

化疗易对心肌造成损伤，药毒伤阴耗气，导致心气虚，出现乏力、呼吸困难等症状。心脏的正常搏动主要依赖于心气。心气作为实现心脏功能的推动力，也是精气化生的能量、血液运行的动力。《素问·平人气象论》记载：“心脏血脉之气也”，心气充盛，心脏才能进行正常的舒缩活动，以此保持正常的心力、心率和心律，血液才能在脉内正常运行。王冰注《素问·五脏生成篇》记载：“气行血乃流”。化疗后期心气虚衰无力动血，心血不行，心血渐虚，无血液的濡养作用，心脏乃至全身的功能受到影响，最终导致气血两虚，易出现胸闷、心悸。

本研究结果显示，当归补血汤发挥治疗作用的成分包括藁本内酯、β-谷甾醇、阿魏酸、黄芪总黄酮(astraisoflavanin)、槲皮素等。单药研究显示，黄芪总黄酮可增加损伤心肌的血流灌注，减轻心肌损伤[11]。当归挥发油能提高PC12细胞存活率，减少受损细胞酸性自噬泡数量，抑制自噬相关蛋白自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin-1)、自噬相关基因5(Atg5)、微管相关蛋白1轻链3(LC3B)-Ⅱ表达[12]，其中苯酞类藁本内酯(ligustilide)可改善微循环、舒张血管、抗心肌缺血[13]。当归植物的不同部位含有不同含量的阿魏酸(ferulic acid)，以尾部中含量最高，阿魏酸钠是传统活血化瘀中药当归和川芎提取物中主要活性成分阿魏酸的钠盐，具有活血、补血、抗炎等多种功效[14]。当归补血汤可促进衰老大鼠血管生成，增加缺血心肌微血管密度，保护损伤心肌，激活PI3K，引起下游Akt进一步表达，信号转至核内，进而引起心肌血管内皮生长因子mRNA表达[15]。

相关研究显示，PI3K/Akt介导的自噬上调被认为是蒽环类药物导致心肌细胞损伤的重要机制之一[16]。有研究显示，自噬涉及心肌肥厚、心肌疾病和缺血性心脏病等重要心肌病理学变化[17]。自噬的发生包括3个阶段：①自噬成核阶段，即胞浆形成自噬前体膜样结构，也称为吞噬泡(phagophore)；②吞噬泡包裹正常或异常细胞器，形成环状结构的自噬小体(autophagosome)；③自噬小体形成后将其内容物运输至溶酶体内，与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome)。哺乳动物细胞内LC3B总量通常不会有较大波动，一般仅出现LC3B-Ⅰ与LC3B-Ⅱ转换，或由自噬溶酶体导致的LC3B-Ⅱ清除，这些现象均间接反映了细胞自噬流状态[18]。这两种情况在免疫印迹法检测中得到类似结果，但代表了不同的生物学终点。有研究表明，阿霉素作用于H9c2细胞导致自噬蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ升高，P62表达降低，诱发心脏毒性反应[19]。有研究显示，阿霉素注射后造成心肌纤维排列紊乱及肌浆空泡化，p-Akt与p-细胞外信号调节激酶(ERK)1/2蛋白水平降低，导致自噬激活、心脏收缩功能下降[20]。当归补血汤治疗心肌损伤的网络药理学预测发现，Akt1为PPI网络的核心基因之一，核心基因的GO基本生物学过程及KEGG通路富集显示，PI3K/Akt通路是当归补血汤干预心脏损伤的关键通路。

综上所述，本研究基于网络药理学方法，构建当归补血汤治疗心肌损伤的药物-成分-靶点-疾病网络，筛选可能发挥作用的关键基因，并进行通路富集，推测当归补血汤治疗心肌损伤可能与PI3K/Akt通路调控的心肌细胞自噬密切相关。