Fonsecaea monophora聚酮合酶基因的CRISPR-Cas9敲除载体的构建

李敏英 黄欢 李倩 骆明芬 王晓悦 刘红芳 曾维英 席丽艳,2

(1.南方医科大学皮肤病医院，实验研究中心，广州 510091；2.中山大学孙逸仙纪念医院皮肤科，广州 510120)

关于Fonsecaea黑化的报道显示，病原体能够产生分泌型的，以及与细胞壁相关的黑色素样组分[1-3]。这些黑色素是免疫激活剂，参与宿主免疫细胞的相互作用[4-5]，而且对抗真菌药物敏感性的影响并不一致[6-8]。Fonsecaeamonophora是近年发现的新种[9]，是我国南方地区着色芽生菌病(chromoblastomycosis, CBM)的主要致病菌[10-11]。真菌黑素的主要合成途径是1，8-二羟基萘(DHN)途径和二羟苯基丙氨酸(DOPA)途径，着色霉菌属主要合成DHN-黑素[12-13]，而聚酮合酶PKS1(polyketide synthases，PKS1)调控DHN-黑素合成起始，常被作为靶点来获得黑素缺陷株。因此，敲除F.monophora聚酮合酶PKS1，研究其对各种环境因素的抵抗力、毒力，对于阐明黑化过程中所涉及的生理过程和疾病的发病机制至关重要。

本研究旨在利用CRISPR-Cas9系统对F.monophora进行基因编辑，但由于原有的pFC334质粒上的筛选基因是鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因(argB)，是营养缺陷型筛选，需先获得argB营养缺陷型菌株，后把进行argB基因载体转化，才能在基本培养基中筛选到阳性转化子，实验过程繁琐，并且原有gRNA骨架上缺乏酶切位点，而pFC332质粒上无gRNA骨架，所以在原有的两个载体上进行改造，简化了实验过程，构建PKS1基因的CRISPR-Cas9敲除载体，以期利用原生质体法获得PKS1基因缺陷株，为研究F.monophoraPKS1基因的功能及DHN-黑素的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

pFC334质粒和pFC332质粒从上海柯雷生物科技有限公司购得。切胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DH5α感受态细胞(北京天根生化科技有限公司)。……