基于网络药理学及其分子对接分析鸡血藤在子宫内膜异位症中的作用机制

庞俏燕，蒋姗珊，王亚静，邵昱玮，游琛，张亚萍

(1.广西中医药大学研究生院，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530001；3.广西中医药大学基础医学院，广西 南宁 530001)

0 引言

子宫内膜异位症(EMs)简称内异症，是原本生长在子宫体的内膜组织，即腺体和间质在子宫体以外的组织部位出现。其常见的临床症状主要进行性加重的痛经、盆腔粘连以及不孕，这些不适症状不仅大大降低了妇女的生活质量及工作效率[1]，而且影响心理健康[2]。内异症虽然属于良性的疾病，恶变的发生几率很小，但具备了恶性肿瘤的种植、侵袭以及远处转移的特征，它发病率大约为10%-15%，近年来也呈现出逐渐上升的趋势。西医治疗主要有服用性激素的假孕疗法和假绝经疗法，或者是手术配合药物治疗，但经治疗后的复发率仍相当高，这是至今治疗的难点。现越来越多的临床数据表明，传统中医的干预治疗可以明显减轻疼痛，增加受孕，减少复发[3-5]。随着中药的基础研究不断深入，中药分子生物学机制可以为我们的治疗提供新思路。

鸡血藤的功用有活血补血、调经止痛、舒经活络，在现代药理研究中，其具有改善造血系统、保护心血管系统、抗肿瘤、抗氧化、双向调节络氨酸、消炎抗菌、镇痛和镇静催眠等作用[6-8]，临床广泛运用于血液及心血管疾病中的贫血、骨髓抑制、风湿性心脏病等；用于神经系统的各种疾病，如中风后半身疼痛、面神经炎；在许多妇科疾病中更是很好的被运用，如月经不调、子宫内膜异位症等[9]。有文献表明，鸡血藤干预子宫内膜异位症具有显著作用[10]，但目前内异症潜在的作用靶点如何被鸡血藤的有效成分干预的研究空白，分子作用机制不明。为了解鸡血藤干预内异症的作用机制，本文运用网络药理学的方法，分析鸡血藤有效成分治疗EMs 潜在机制，为鸡血藤治疗EMs提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 鸡血藤有效成分筛选及靶点基因的预测

运用TCMSP数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)检索鸡血藤的有效成分，以药物相似性DL> 0.18及口服生物利用度OB (%)>30作为检索的依据收集符合条件的有效成分，并在平台中“Targets information”收集此有效成分的靶蛋白名称，然后运用Perl软件对收集到的有效成分及其靶蛋白进行规范化处理，获得相对应的靶基因的全名和具有基因编码的靶基因。

1.2 EMs相关靶点基因的收集

检索鸡血藤的系列靶点，把“endometriosis”作为检索的一个关键词，在GeneCards (https://www.genecards.org/)和OMI数据库(https://www.omim.org/)分别下载相对应的该疾病的靶基因，并将这两部分的靶基因合并在一起。

1.3 网络合并

使用R语言对药物基因靶点与疾病基因靶点取交集，采用VennDiagram包绘制韦恩图，并将鸡血藤的相关靶点与EMs的相关靶点交集关联，得到鸡血藤干预EMs的重要靶点，采用Cytoscape 3.7.2软件将以上成分进行可视化分析。

1.4 蛋白互作网络的构建

为了解靶点所表达的蛋白相互作用的信息，确定核心靶基因，把鸡血藤干预EMs的相关靶点基因上传至STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)平台构建PPI网络图。再利用R语言软件根据节点之间的关系程度选出PPI网络中前20位靶基因，以更好解地了鸡血藤通过靶基因作用治疗EMs。

1.5 GO分析和KEGG通路分析

采用基因本体论(GO)和通路富集来分析靶基因，利用Bioconductor 中的“clusterProfiler”“DOSE”和“pathview”三个包对靶基因进行GO和 KEGG富集分析，得到GO和KEGG的富集图及气泡图。

1.6 分子对接

通过pubchem网站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索获取化合物的SDF结构文件，从 Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb) 数据库中检索获得七个受体蛋白，利用PYMOL 2.3.4软件对这些受体蛋白进行去水、去配体等操作，再采用AutoDockTools软件对这几个受体蛋白进行加氢、平衡电荷等修饰，利用AutoDock Vina 1.1.2对这七个受体蛋白与五个配体小分子分别进行分子对接。

2 结果

2.1 鸡血藤的重要活性成分的筛选

通过阈值设定OB≥30%，DL≥0.18，在TCMSP平台上共收集鸡血藤的24活性化合物作为主要的有效成分，并对各预测的活性成分进行编号(MOL ID)。鸡血藤的主要化学成分基本信息见表1。

表1 鸡血藤的主要有效成分

2.2 鸡血藤和EMs的基因靶点预测

采用TCMSP数据库检索出鸡血藤成分的基因靶点(Gene Target)428个，并采用Uniprot数据库据中药成分的靶点检索到相应的人类的已知基因靶点(Gene Symbol)，排除未找到的，共获取175个基因靶点Gene Symbol)，去除重复的119个重复发靶点，获得鸡血藤对应的靶点基因56个。采用Gene Cards (https://www.genecards.org/)及OMIM (https://www.genecards.org/)数据库检索与EMs对应的基因1446个。

2.3 网络合并

利用R语言软件“VennDiagram”将1446个EMs对应的基因与56个鸡血藤作用的靶点做交集，共获得35个靶点基因，绘制韦恩图(图1)。采用Cytoscape3.7.2软件将鸡血藤24个有效成分和35个靶基因组合构建“成分-靶点-疾病”交互网络结构图，如图2所示，红色菱形代表EMs疾病，与之相连的绿色椭圆形代表35个靶基因，蓝色长方形代表24个有效成分。最后通过拓扑学分析发现木犀草素(luteolin)、甘草查尔酮(licochalcone a)、芦荟大黄素(aloe-emodin)、8-邻甲基雷公藤(8-o-Methylreyusi)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)等8个有效成分发挥主要作用，见表2。

图1 EMs相关基因与鸡血藤作用靶点的交集

图2 鸡血藤作用于EMs的有效成分-靶基因的关系

表2 关系网络中有效成分节点的拓扑学分析

2.4 PPI网络的构建

利用STRING数据库，构建鸡血藤治疗EMs相关靶点的PPI网络网络图(图3)，共发现34个节点，263条相互作用关系，每一个节点代表一个靶基因，每条边则代表两个的靶基因之间的关系，线条越多则表示之间的关联的越大(图4)，其中关联度较大的有靶基因有MYC、CCND1、EGFR、ESR1、VEGFA、CASP3、IL6，这些靶基因可能为鸡血藤治疗EMs的重要作用靶点。

图3 靶基因的PPI网络

图4 关系较为密切的前20靶基因

2.5 GO富集分析

通过Bioconductor对靶基因进行GO和KEGG富集分析，发现靶基因的GO主要涉及DNA集合转录因子、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子、激素受体等(图5)；KEGG 信号通路主要富集在前列腺癌、人巨细胞病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等(图6)，通路中较为重要的是PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、TNF signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、VEGF signaling pathway、Estrogen signaling pathway、JAK-STAT signaling pathway等(表3)。

图5 GO富集分析气泡图

图6 KEGG富集分析气泡图

表3 靶基因的重要通路

2.6 潜在活性成分-靶蛋白分子对接

AutoDock Vina将结果以一种亲和能(Affinity)的形式输出，通过计算受体-配体复合物的空间效果、排斥作用、氢键、疏水相互作用以及分子的灵活性等值综合打分，评估其亲和力，最终给出亲和能打分，这种亲和能是衡量配体是否能与受体分子有效结合的重要指标，是AutoDock Vina软件的核心参数，能值越低，二者的结合效果越好。一般认为结合性较好的标准为：能值≤-5.0kcal/mol。根据对接的结果(表四)，鸡血藤中的5种核心活性成分与MYC、CCND1、EGFR、ESR1、VEGFA、CASP3、IL6的分子对接结合能均小于-5.0 kcal/mol，表明鸡血藤的中药活性成分与靶点蛋白之间具有良好的结合能力。

表4 潜在活性成分-靶蛋白分子对接

3 讨论

子宫内膜异位症依据患者最主要的不适症状，在祖国医学上的病名曰“痛经、癥瘕、不孕”等。刘晓杰[11]参考31篇关于内异症的中医药研究进展，总结其它的病因病机为气滞血瘀、气虚血瘀、肾虚血瘀、热灼血瘀、寒凝血瘀、痰湿血瘀，由此可知内异症的总病机为血瘀，在中医治则中也始终贯穿活血化瘀的治法。在中药理论中，配伍不当或长久用活血化瘀大必然耗伤正气，而鸡血藤作为活血化瘀的常用药，善入血份，其特点在于活血不留瘀，祛瘀而不伤正，是治疗妇科疾病的要药[12-13]。如国医大师班秀文善用鸡血藤治疗妇女的痛经、癥瘕、不孕等妇科病症。鸡血藤在现代药理学中的一个作用为抗肿瘤，而内异症在临床行为学上具有种植、侵袭、转移的恶性肿瘤的特点，鸡血藤可能在治疗内异症发挥抗肿瘤的作用，但这待进一步的研究。

3.1 子宫内膜异位症与靶基因探讨

子宫内膜异位症的发病机制目前还没有完全明确的定论，现在普遍支持的是“经血逆流学说”，随着经血逆流的子宫内膜碎片进入腹膜发展成子宫内膜异位症必须避免免疫清除，附着于腹膜上皮，侵入上皮，建立局部神经血管以持续生长和存活，而完成在此机制中涉及激素调节、细胞凋亡、血管生成及炎症反应[14]。在PPI网络的关联度较大的靶基因中，C-myc是雌激素的靶基因，参与细胞的调控，MYC的上调与EMs的发生有关[15-16]。CCND1亦可能参与细胞的调控，阿艳妮[17]通过检测40例卵巢子宫内膜异位囊肿患者的CCND1，阳性率高达72.50%，结果显示该疾病的发生与CCND1可能存在一定关系，病因可能为CCND1的过度表达使细胞的增殖异常，促使子宫内膜在子宫体以外殖、种植、侵袭和破坏。CASP3是细胞细胞凋亡的关键蛋白酶，有研究表明CASP3可能是EMs严重程度的可靠预测指标[18]。子宫内膜异位植入物需要新血管形成才能扩散并侵入宿主内的异位部位，VEGFA是血管内皮生长因子，其已成为EMs的关键血管生成调节剂[19]。异位病灶局部的高雌激素与雌激素受体结合使组织细胞的增殖、黏附、凋亡等方面异常，加快了内异症的形成[20]。有研究表明，EMs患者腹膜液中白介素(IL)-6的浓度升高，腹膜液中IL-6R的增加通过增强IL-6的生物活性而促进子宫内膜异位症的发展[21]。通过上述分析的靶基因，发现这些重要的靶基因与细胞凋亡、雌激素、血管生成、炎症反应等的关系紧密，这和EMs的发病机制相符合。

3.2 KEGG通路探讨

分析鸡血藤治疗子宫内膜异位症的通路，PI3K-Akt和MAPK信号通路影响EMs的黏附、侵袭、血管生成、细胞凋亡，并受激素水平调控[22]，鸡血藤可能通过调控这两条通路的过度激活控制MEs的发展。TNF-α是炎症因子，可作为诊断子宫内膜异位并发不育症的重要参考指标[23]，鸡血藤可能通过调节TNF信号通路，减少TNF -α对子宫内膜产生的炎症反应而达到治疗的效果。HIF-1α是缺氧诱导因子，其和VEGF在EMs患者增生期内膜组织中的表达呈正相关，均可促进子宫内膜异位症血管的生成[24]，鸡血藤可能通过抑HIF-1 信号通路和VEGF信号通路的高表达而控制EMs的发展进程。AK-STAT信号通路可直接参加EMs的发生发展[25]，鸡血藤可能通过此通路抑制新生血管的形成从而阻断EMs的发展。通过上述通路的分析，鸡血藤干预子宫内膜异位症涉及调节激素分泌、控制炎症反应、抑制细胞及血管生成的通路。

本研究采用网络药理学方法分析鸡血藤对子宫内膜异位症的作用机制，为研究鸡血藤有效成分对EMs的作用提供理论依据。然而，本文仅是利用在线数据库筛选鸡血藤有效成分作用于EMs的靶基因、通路，但仍需通过实验研究加以验证。