基于网络药理学探讨大黄辅治急性胰腺炎的作用机制

余涵

(湖北中医药大学，湖北 武汉 430000)

0 引言

急性胰腺炎是临床常见的消化内科疾病，主要是胰酶被激活后引起胰腺组织自身消化而导致症反应[1]。临床以急性上腹痛、恶心、呕吐、发热和血胰酶增高等为特点。病变程度轻重不等，临床病理常把急性胰腺炎分为轻度急性胰腺炎、中度急性胰腺炎及重度急性胰腺炎。临床上，大多数患者的病程呈自限性，20%～30%患者临床经过凶险，总体病死率5%～10%。中国急性胰腺炎诊治指南2019年版指出MAP的治疗以禁食、抑酸、抑酶及补液治疗为主，补液只要补充每天的生理需要量即可，一般不需要进行肠内营养[2]。对于MSAP及SAP需要采取器官功能维护、应用抑制胰腺外分泌和胰酶的抑制剂、早期肠内营养、合理使用抗菌药物、处理局部及全身并发症、镇痛等措施。中医多以症状命名，故急性胰腺炎无中医专属名称[3]。根据古人对胰腺及类似急性胰腺炎症状的描述，现在人们多把急性胰腺炎归为“腹痛”“脾心痛”“脾实”和“结胸”来进行研究。中医认为感受六淫之邪、饮食不洁(醇酒肥甘)、情志不舒、胆石、虫积、创伤等因素是急性胰腺炎的主要病因，基本病机为气、湿、热结聚不散则酿生热毒，热毒炽盛又易致血热妄行而致血瘀，热毒血瘀互结，腑气不通[4]。中医药治疗急性胰腺炎途径多，可以有效减少复发，副作用相对较小[5]。

大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatumL.>唐古特大黄 Rheu tanguticum Maxim.exBalf. 或药用植物大黄 Rheum officinale Baill. 的干燥根或根茎。性味归经：苦，寒，归脾胃、大肠、肝、心包经。功效：泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄[6]。现代医学研究发现，大黄内含番泻苷A、大黄酸蒽酮苷和大黄酸蒽酮等多种成分[7]。Wan B等[8]提出番泻苷A具有刺激肠蠕动、促进肠液分泌、增强肠张力、软化大便、改善肠麻痹、促进排气、排便的作用；Yao P等[9]认为大黄通过松弛oddi括约肌达到促进胰液及胆汁的排泄功能，可有效缓解患者腹痛、腹胀，缩短血清淀粉酶恢复时间。大黄酸蒽酮苷和大黄酸蒽酮可在小肠吸收，经肝脏转化作用于骨盆神经丛和黏膜神经丛，使肠蠕动增加，进而达到导泻、减少肠道内细菌移位、下调炎症相关因子表达的功效[10]。

网络药理学可结合海量数据库[11](DrugBank、STITCH、ChEMBL、OMIM、KEGG、TCMID、TCMSP等数据库)可研究药物、靶标和疾病之间的关系，可通过整合中药化学成分、疾病靶标构建“化学成分-作用靶标-疾病靶标-蛋白质相互作用网络”[12]。将网络药理学应用于中药复方的研究，既反应了大数时代生物医药系统性研究的新趋势，又适应了中医药对系统性研究方法的需求，且能很好地与我国传统中医药结合而体现其原创性[13]。在此运用网络药理学探讨大黄辅治AP的作用机制，为今后中药治疗AP提供思路和方向。

1 资料与方法

1.1 药物中活性成分及药物靶点的筛选

通过中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/)，检 索 大 黄 的 化 学 成分，通过口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)及类药性(Drug-likeness，DL)的筛选条件(OB≥30%，DL≥0.18)进行筛选。筛选出符合条件的化学成分作为活性成分并得到相关靶点，借助疾病靶点标准化数据库(Universal protein，UniProt)(https://www.uniprot.org/)查询相关靶点对应的基因名。

1.2 药物活性成分-靶点的网络构建

将大黄的活性成分及相关靶点，上传至网络可视化软件Cytoscape (V3.7.1)(http://www.cytoscape.org/)构建活性成分-靶点网络。

1.3 疾病靶点的检索及活性成分-疾病共有靶点的筛选

通过Genecard 数据库(https://www.genecards.org/)以“Acute pancreatitis”为关键词检索目前已报道的与急性胰腺炎相关的靶点基因。将“1.1”项中活性成分靶点基因与“1.3”中疾病靶点基因分别输入韦恩图网站(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)，得到的重合靶点即为“大黄”治疗急性胰腺炎的潜在靶点。

1.4 蛋白互作网络(Protein-protein interaction,PPI)的构建

将筛选得到的潜在靶点导入String (https://string-db.org/)数据库，选择“multiple proteins”模式，蛋白种属设置为“Home sapiens”，最小互作分数值为0.4，其余参数保持不变，得到PPI相互作用关系图，保存其TSV格式文件。

1.5 GO富集分析和KEGG富集分析

将共同靶标同时导入Metascape生物分子功能注释系统(www.metascape.org/)进行GO基因本体功能和KEGG通路富集分析，设置P Value Cutoff为0.01，选择生物过程(Biological Processes)、分子功能(Molecular Functions)、细胞组成(Cellular Components)、KEGG通路(KEGG Pathway)进行富集分析。

2 结果与分析

2.1 大黄化合物-靶点网络

由TCMSP数据库检索“大黄”，以OB≥30%、DL≥0.18作为检索条件并进行筛选后，得到的大黄活性成分为16个，见表1。将这16个活性成分经由TCMSP查询成分相关靶点，去重后共得到62个相关靶点。借助Uniprot数据库查询相关靶点的基因名。

2.2 药物活性成分-靶点网络构建

将得到的16个活性成分及62个相对应的靶点关系保存为EXCEL文件，通过可视化软件Cytoscape3.7.1构建网络，得到“大黄”的活性成分-靶点网络图，共得到78个节点，见图1。

图1 “大黄”活性成分-靶点网络图

2.3 疾病靶点的检索及活性成分-疾病共有靶点的筛选

通过Genecards 数据库检索“Acute pancreatitis”，得到922个急性胰腺炎相关的基因。将活性成分靶点基因与急性胰腺炎相关基因通过韦恩图得到两者交集，共有靶点为21个，即为“大黄”治疗急性胰腺炎的潜在靶点。韦恩图如图2。

图2 韦恩图

2.4 蛋白互作网络(PPI)构建及核心靶点的筛选

将“大黄”治疗急性胰腺炎21个潜在靶点输入String数据库，得到靶点间的相互作用关系图，运用Cytoscape 3.7.1软件图构建PPI网络图(如图3)，其中共有21个节点和90条边，平均节点度值8.57，经过网络拓扑分析筛选出11个核心靶点，包括环加氧酶2(PTGS2)、肿瘤坏死因子(TNF)、周期素依赖性激酶抑制因子1B (CDKN1B)、CHEK1等，提示以上靶点是大黄治疗急性胰腺炎的核心靶点，如图3。

图3 PPI网络图

图4 GO富集分析

2.5 通路富集分析

将核心靶点导入Metascape数据库中进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，其中得到了GO分析14个富集条目，主要涉及生物过程(Biological Processes)7个，如积极调控细胞死亡(positive regulation of cell death)、神经元死亡的积极调控(positive regulation of neuron death)、DNA损伤反应的信号转导(signal transduction in response to DNA damage)、调节血管平滑肌细胞增殖(regulation of vascular smooth muscle cell proliferation)等，分子功能(Molecular Functions)5个，如半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡信号通路(cysteinetype endopeptidase activity involved in apoptotic signaling pathway)、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂活性(cyclin-dependent protein serine/threonine kinase inhibitor activity)、蛋白激酶结合(protein kinase binding)、泛素蛋白连接酶结合(ubiquitin protein ligase binding)等，细胞组成(Cellular Components)2个，膜筏(membrane raft)、转移酶复合体(transferase complex)。大黄治疗急性胰腺炎的核心靶点GO富集分析如图，从上至下分别为BP、MF、CC。

由KEGG富集分析结果可知，大黄治疗急性胰腺炎的核心基因富集的通路有9条，主要通路涉及乙型肝炎通路、癌症途径通路、P53信号通路、IL-17信号通路、内分泌抵抗通路及癌症中蛋白聚糖通路等，见图5。

图5 KEGG富集分析

3 讨论与结论

Peery AF等[14]人在2015年发表的文章指出，在美国，AP在因消化病而收入院的患者中排名第3。每年有超过275000例患者因AP收入院，其中超过2000例死亡，造成的直接经济损失高达26亿美元。在过去30年中，AP发病率呈逐渐上升的趋势，但发病率的上升可能与影像诊断技术的提高有一定关系[15]。AP发病的病因主要为以胆源性为主，其次是酒精和高脂血症。AP的总体死亡率较低，不到1%，但SAP死亡率较轻症明显上升，18%～40%不等，高龄是AP病人死亡的独立危险因素。大黄始载于《神农本草经》，原文中如此记载“下瘀血，血闭寒热，破癥瘕积聚，留饮宿食，荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷，调中化食，安和五脏”[16]。有学者指出急性胰腺炎多属于气机不畅，实热壅结的里热实证，根据“六腑以通为用”的原则，治疗多以清里攻下法，大黄兼有清热、逐淤、泻下功能，故能以此治疗急性胰腺炎。

本研究通过TCMSP数据库的OB和DL筛选出大黄16个活性成分，对应21个AP靶点，通过富集分析得到9条信号通路。网络分析结果显示大黄可能通过PTGS2、TNF、CDKN1B、CHEK1等靶点发挥治疗AP的作用。由KEGG富集分析可知，核心靶点主要调控p53信号通路、小细胞肺癌信号通路、IL-17信号通路等，p53通路涉及肿瘤抑制，调节各种基因的表达，包括细胞凋亡、生长抑制、抑制细胞周期进程、分化和加速DNA修复，基因毒性和细胞应激后的衰老等重要的生物进程，p53可促进Bax、抑制Bcl-2表达，诱导细胞凋亡。而激活p53信号通路可诱导细胞凋亡，加速细胞应激后的衰老[17]。IL-17可以直接或间接诱导多种细胞因子、趋化因子、炎症因子和抗微生物蛋白来识别介导自身免疫和慢性感染的靶基因IL-17可以直接或间接诱导多种细胞因子、趋化因子、炎症因子和抗微生物蛋白来识别介导自身免疫和慢性感染的靶基因。IL-17可以被认为与机体的多种炎症反应相关，Kondo S[18]研究指出IL-17是急性胰腺炎病情加重的关键机制之一。因此通过抑制IL-17信号通路进而减少AP进展中的炎性因子表达。

综上，中药及其复方具有多成分、多途径、多靶点协同作用的特点。近10年来，随着现代基因组学、蛋白质组学、代谢组学等“组学”理论的发展，系统生物学视角的引入以及生物信息学的应用[19]。网络药理学(network pharmacology)概念应运而生，它是在系统生物学与计算机技术高速发展的基础上发展起来的，基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络的基础上，通过网络分析，系统综合地观察药物对疾病网络的干预与影响，揭示多分子药物协同作用于人体的奥秘[20]。本文基于网络药理学研究大黄治疗急性胰腺炎的具体作用靶点及机制，望对未来临床运用大黄治疗急性胰腺炎有一定的指导作用[21]。