采用组合策略提高灰色链霉菌胰蛋白酶在毕赤酵母中的表达

彭文坚，张娟，刘松*

1(粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)2(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)

胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)是一种碱性蛋白酶，能专一性催化蛋白质肽链中精氨酸(R)或赖氨酸(K)残基羧基端的肽键或酰胺键的水解[1]。胰蛋白酶已经广泛应用于皮革软化、洗涤、食品和制药工业，约占工业酶制剂市场的3%[2]。目前大部分市售胰蛋白酶主要从猪、牛、羊等哺乳动物[3]的胰腺组织提取。然而，哺乳动物组织提取物通常具有免疫原性及病原体污染[4]等隐患，限制了其在食品与医药领域的应用。因此，微生物来源胰蛋白酶的开发成为重要研究方向。

目前动物来源胰蛋白酶的异源表达以猪胰蛋白酶为主要研究对象，其在大肠杆菌中以包涵体形式表达，在包涵体复性后，最高产量为209 mg/L活性胰蛋白酶[5](2 L发酵罐)。在毕赤酵母中，猪胰蛋白酶以酶原的形式表达，产量为480 mg/L，经肠激酶激活后酶活力可达19.2 U/mL[6](5 L发酵罐)。微生物来源胰蛋白酶主要研究对象为尖孢镰刀菌胰蛋白酶(Fusariumoxysporumtrypsin，FOT)与灰色链霉菌胰蛋白酶(Streptomycesgriseustrypsin, SGT)。FOT在毕赤酵母中以成熟酶的形式表达，酶活力为2.7 U/mL(摇瓶水平)[7]。重组SGT在大肠杆菌中同样以包涵体形式存在，而在变铅青链霉菌与枯草芽孢杆菌中SGT以成熟酶的形式实现了活性表达，最大酶活力分别为9.21 U/mL(摇瓶水平)[8]与33.8 U/mL(摇瓶水平)[9]。针对SGT表达量低、酶原活化效率低和稳定性差等问题，本研究室通过融合高效分泌信号肽、自活化前导肽、疏水性前导肽及自降解位点突变(R145I/K101A/R201V)等策略[10-12]，实现了SGT在毕赤酵母中的高效活性表达，5 L发酵罐的酰胺降解酶活力为549.18 U/mL，是目前文献报道的重组SGT最高产量。……