MANF对A2型反应性星形胶质细胞增殖、凋亡的影响

刘 锐,丁振飞,戴 策,钟 林,汪萧和,尹宗生,高维陆

星形胶质细胞在神经系统中所占的比例最大，在神经胶质细胞中分布最为广泛，也是胶质细胞中体积最大的一种。中枢神经系统中的星形胶质细胞能够对不同性质的刺激做出不同的反应，活化为具有消极作用的A1型反应性星形胶质细胞(reactive astrocytes,RAS)和有积极作用的A2型RAS。有研究表明，白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)可以使星形胶质细胞向A2型RAS转化。中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor, MANF)是近年来新发现的一种分泌型蛋白，存在于内质网和高尔基体中。MANF能够在多种细胞中发挥生物学功能。但其在脊髓损伤中对RAS的影响却未见相关文献报道。该研究拟通过在体外进行大鼠脊髓星形胶质细胞的培养，并制备A2型RAS，采用不同浓度的MANF处理，并检测其对A2型RAS增殖、凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

胎牛血清、DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)；重组MANF蛋白、小鼠抗S100A10单克隆抗体(美国R&D Systems公司)；CCK-8试剂(上海陶素生化科技有限公司)；链霉素-青霉素、EdU试剂盒、TUNEL试剂盒(上海Beyotime生物技术公司)；兔抗GFAP单克隆抗体(美国Abcam公司)。倒置荧光显微镜(德国蔡司公司)，酶标仪(美国PE公司)。

1.2 实验动物

SPF级SD大鼠50只，3～4周龄，雌雄不拘，由安徽省实验动物中心提供。

1.3 方法

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星形胶质细胞的制备 SD大鼠脱颈处死后，在无菌条件下取出脊髓组织，迅速转入含有用冰预冷的PBS液的培养皿中，用眼科剪将组织块剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，反复吹打后经200目细胞筛过滤，滤液收集于15 ml离心管中，转入离心机离心5 min，转速为800 r/min，然后弃上清液，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12星形胶质细胞培养液2 ml，之后用枪头反复吹打细胞悬液使其重悬均匀。……