基于基因编辑技术的DMD人诱导多能干细胞模型构建

王 伟， 林 翔， 陈万金， 王 柠， 金 铭

杜氏进行性肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一种致死性的X连锁隐性遗传病，是儿童最常见的遗传性神经肌肉疾病，发病率为(10.71～27.78)/105[1]。致病原因为X染色体上的dystrophin基因发生突变，导致编码的细胞骨架蛋白Dystrophin的功能缺失以及持续性的肌纤维退行性变，造成肌纤维的强度和稳定性下降，出现进行性肌肉萎缩。患者常在13岁前失去独立行走能力，20～30岁时因心肺功能衰竭而死亡，目前尚无成熟有效的治疗手段[2]。

在DMD的治疗研究中，除了大规模的药物临床试验，主要使用各类研究模型，常见的有小鼠、犬、猪和猴，以及人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)等[3-6]，其中作为遗传特性与人体最为接近的hiPSCs，由于可以定向分化为肌肉组织，是目前研究肌肉疾病最重要的体外模型，在基因编辑治疗、长链非编码RNA治疗和小分子药物筛选方面都发挥了重要作用[7-9]。hiPSCs由已终末分化的细胞通过重编程的方式，重新获得与胚胎干细胞相同的多向分化与自我更新能力[10]。然而，人体来源的hiPSCs依赖于患者组织的获取，如皮肤、血液、尿液等，获取渠道有限，对于一些特殊类型获取难度较大。本研究拟通过CRISPR-Cas9技术，在正常hiPSCs中切除dystrophin基因的52号外显子，从而引入大片段缺失突变，构建DMD细胞模型，为后续治疗研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)细胞：293T细胞由中国科学院干细胞库提供；正常的hiPSCs为本团队前期研究中通过重编程方式获得[11]。(2)试剂：SpCas9表达载体构建自张锋实验室的PX-330(42230，美国Addgene公司)；干细胞培养基Essential 8TMMedium(A1517001，美国Thermo Fisher Scientific公司)；……