西红花花瓣化学成分研究

刘书蒙，王 蓉，胡晓龙，熊 非，汪 豪**

1 中国药科大学 中药学院，南京 210009；2 东南大学 生物科学与医学工程学院，南京210009

西红花为鸢尾科多年生草本植物西红花（Crocus sativus L.）的干燥柱头，亦称藏红花、番红花。具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神的功效。西红花药材价格昂贵，产量低，在其种植及采集过程中，大量花瓣作为废料而丢弃，资源浪费严重。文献报道，西红花花瓣提取物对抑郁症、阿尔茨海默病、眼睛黄斑变性等疾病具有改善作用[1]。为了揭示西红花花瓣药效物质基础及为西红花花瓣综合开发利用提供科学依据，本研究对西红花花瓣进行较为系统的化学成分研究。共分离鉴定9 个化合物，分别为:苯乙醇-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（1），苄醇-1-O-[6′-O-（S）-3′′-羟基-3′′-甲基戊二酸单酯]-β-D-吡喃葡萄糖苷（2），苯乙醇-1-O-[6′-O-（S）-3′′-羟基-3′′-甲基戊二酸单酯]-β-D-吡喃葡萄糖苷（3），4-羟基苯甲酸4-O-α-L-吡喃鼠李糖-1-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷（4），4-羟基苯甲酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（5），菠甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（6），山柰酚（7），山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（8），山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（9）。各成分结构见图1。其中化合物4 为新化合物，化合物1～3，5～6 均为首次从该植物中分离得到。通过对皮质酮诱导PC12 细胞损伤的保护作用的评价，化合物2～5 具有中等神经保护作用。见表1。

表1 化合物对皮质酮诱导的PC12 巨噬细胞损伤的保护作用（n=3）

图1 化合物1～9 结构式

1 材料与仪器

西红花（Crocus sativus L.）花瓣，于2018 年11月采自云南迪庆，经中国药科大学汪豪教授鉴定为西红花（Crocus sativus L.）花瓣，标本存放于中国药科大学天然药物化学研究室。

Avance-300 or 500 核磁共振仪（德国Bruker 公司）；Agilent 1260 高效液相色谱仪、Agilent 6210 QTOF 质谱仪（美国Agilent 公司）；LC-20AP 制备HPLC、LC-MS 2020 质谱仪（日本Shimadzu 公司）；MCP500高精度自动旋光仪（奥地利Aton Paar 公司）。

HPD-100 型大孔吸附树脂（0.3～1.2 mm，天津海光化工有限公司）；高效薄层色谱硅胶预制板（烟台化工研究所）；Sephadex LH-20 色谱填料（瑞典Pharmacia 公司）；ODS 色谱填料（50μm，日本YMC 公司）。

2 方 法

2.1 提取与分离

西红花花瓣0.78 kg，干燥后粉碎，95%乙醇室温浸渍提取（7d×3），合并醇提液，减压回收至浸膏状，加水混悬后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，得到各萃取部位浸膏。合并乙酸乙酯和正丁醇萃取部位，上样于HPD-100 大孔吸附树脂柱，乙醇-水梯度洗脱，分别得到水，20%、40%、60%、80%、100%乙醇洗脱部位。取60%乙醇洗脱部位经Sephadex LH-20、ODS 柱色谱及制备型HPLC 制备分离，得到化合物1（22.3 mg），2（16.1 mg），3（9.8 mg），4（13.7 mg），8（53.9 mg），9（38.2 mg）。取20%乙醇洗脱部位经Sephadex LH-20 及ODS 柱色谱分离，得到5（34.5 mg）。取80%乙醇洗脱部位经Sephadex LH-20 柱色谱分离，得到化合物7（25.8 mg）。石油醚萃取部位浸膏，加硅胶（100～200 目）拌样，上样于硅胶（200～300 目）柱，以氯仿-甲醇梯度洗脱（100∶1→1∶1），氯仿-甲醇（8∶1）洗脱部位经反复硅胶柱色谱分离纯化，得到化合物6（56.2 mg）。

2.2 皮质酮诱导PC12 细胞损伤模型

用含10%胎牛血清的DMEM 培养液（含青霉素钠200U·mL-1,链霉素100μg·mL-1，pH7.4）PC12 细胞稀释为每毫升含1×105个细胞，接种于96 孔培养板，每孔100μL，放入37℃、5% CO2孵箱培养，待细胞长满孔底后，吸去培养液。然后，空白组和模型组加入100 μL 空白培养液，其余各孔加入不同浓度的化合物1～9 和氟西汀，预给药4 h。随后，弃去上清液，加入100μL 含皮质酮的培养液（皮质酮终浓度为700 μmol·L-1），刺激24h。最后，每孔加入10μL MTT 溶液（终浓度为0.5mg·mL-1），继续培养4h 后弃去上清液，加入150 μL 二甲基亚砜（DMSO），振荡，待蓝色结晶完全溶解，用酶标仪测定570nm 波长处的吸光度（A值），计算细胞保护率，求得EC50值（Graphpad 8.0）。

3 结果

3.1 结构鉴定

图2 化合物4 的关键信号

表2 化合物4 的核磁数据

化合物1 白色粉末，ESI-MS m/z：307 [M+Na]+，分子式为C14H20O6。1H-NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ:7.43-7.13（5H，m，H-2，3，4，5，6），4.19（1H，d，J=7.5 Hz，H-1′），3.94（1H，q，J=8.6，7.8 Hz，H-αb），3.65（1H，m，H-αa），3.43-2.91（Glc-H），2.85（2H，t，J=7.0 Hz，Hβ）；13C-NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ：138.7（C-1），128.1（C-2，6），128.8（C-3，5），126.0（C-4），35.6（C-β），70.1（C-α），102.8（C-1′），73.4（C-2′），76.8（C-3′），69.4（C-4′），76.8（C-5′），61.1（C-6′）。与文献对照[3]，鉴定化合物1 为苯乙醇-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物2 白色粉末，HR-ESI-MS m/z:413.1449[M-H]-，分子式为C19H26O10。1H-NMR（300 MHz，CD3OD）δ：7.41（2H，m，H-3，7），7.38-7.24（3H，m，H-4，5，6），4.85（1H，br s，H-1b），4.62（1H，d，J=12.0Hz，H-1a），4.49（1H，d，J=11.3 Hz，H-6′b），4.37（1H，d，J=7.0 Hz，H-1′），4.24（1H，dd，J=11.3，5.5 Hz，H-6′a），3.45（1H，m，H-5′），3.35（2H，m，H-3′，4′），3.27（1H，s，H-2′），2.76（2H，s，H-2′′），2.69（2H，s，H-4′′），1.40（3H，s，3′′-Me）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：71.8（C-1），138.9（C-2），129.1（C-3，7）,129.3（C-4，6），128.7（C-5），172.4（C-1′′，5′′），46.3（C-2′′），70.7（C-3′′），27.7（3′′-Me），45.9（C-4′′），103.2（C-1′），74.8（C-2′），77.7（C-3′），71.4（C-4′），75.9（C-5′），64.6（C-6′）。与文献对照[4]，鉴定化合物2 为苄醇-1-O-[6′-O-（S）-3′′-羟基-3′′-甲基戊二酸单酯]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物3 白色粉末，HR-ESI-MS m/z：427.1607[M-H]-，分子式为C20H28O10。1H-NMR（300 MHz，CD3OD）δ：7.25（4H，brs，H-4，5，7，8），7.18（1H，s，H-6），4.46（1H，d，J=11.5 Hz，H-6′b），4.32（1H，d，J=7.1 Hz，H-1′），4.21（1H，dd，J=11.0，4.2 Hz，H-6′a），4.02（1H，q，J=7.3 Hz，H-1b），3.76（1H，q，J=8.4，7.8 Hz，H-1a），3.47（1H，s，H-5′），3.32（2H，m，H-3′，4′），3.20（1H，t，J=6.7 Hz，H-2′），2.93（2H，t，J=6.6 Hz，H-2），2.71（2H，s，H-2′′），2.65（2H，s，H-4′′），1.36（3H，s，3′′-Me）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：71.8（C-1），37.0（C-2），139.8（C-3），129.8（C-4，6），127.1（C-5），172.3（C-1′′，5′′），46.5（C-2′′），70.7（C-3′′），27.7（3′′-Me），45.9（C-4′′），104.3（C-1′），74.8（C-2′），77.8（C-3′），71.5（C-4′），75.1（C-5′），64.7（C-6′）。与文献对照[4]，鉴定化合物3 为苯乙醇-1-O-[6′-O-（S）-3′′-羟基-3′′-甲基戊二酸单酯]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物5 白色粉末，ESI-MS m/z：301[M+H]+，分子式为C13H16O8。1H-NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ:7.88（2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6），7.09（2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5），4.98（1H，d，J=7.5 Hz，H-1′），3.69（1H，d，J=11.6 Hz，H-6′b），3.47（1H，dd，J=11.7，5.4 Hz，H-6′a），3.37（1H，m，H-2′），3.27（2H，t，J=6.2 Hz，H-3′，4′），3.18（1H，d，J=11.1 Hz，H-5′）；13C-NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ：166.9（C-7），124.3（C-1），130.9（C-2，6），115.7（C-3，5），160.6（C-4），100.0（C-1′），73.1（C-2′），76.5（C-3′），69.7（C-4′），77.0（C-5′），60.6（C-6′）。与文献对照[5]，鉴定化合物5 为4-羟基苯甲酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物6 白色片状晶体，ESI-MS m/z：613[M+K]+，分子式为C35H58O6。1H-NMR（300 MHz，Pyridined5）δ：5.20（2H，m，H-7，23），5.10（1H，d，J=8.4 Hz，H-22），5.04（1H，d，J=7.5 Hz，H-1′），4.60（1H，d，J=11.5 Hz，H-6′b），4.42（1H，dd，J=11.6，5.1 Hz，H-6′a），1.09（3H，d，J=6.4 Hz，18-CH3），1.00（3H，d，J=6.4 Hz，21-CH3），0.89（6H，m，26，27-CH3），0.74（3H，s，29-CH3），0.59（3H，s，19-CH3）；13C-NMR（75 MHz，Pyridine-d5）δ：37.8（C-1），30.4（C-2），79.1（C-3），35.2（C-4），40.7（C-5），30.0（C-6），118.3（C-7），139.9（C-8），50.1（C-9），35.0（C-10），22.2（C-11），39.8（C-12），43.9（C-13），55.4（C-14），23.8（C-15），29.3（C-16），56.6（C-17），12.6（C-18），13.5（C-19），31.2（C-20），21.7（C-21），139.0（C-22），130.1（C-23），51.9（C-24），32.6（C-25），22.1（C-26），19.7（C-27），26.1（C-28），12.9（C-29），102.8（C-1′），75.8（C-2′），77.7（C-3′），72.3（C-4′），78.8（C-5′），63.4（C-6′）。以与文献对照[6]，鉴定化合物6 为菠甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物7 黄色粉末，ESI-MS m/z：285[M-H]-，分子式为C15H10O6。1H-NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：8.05（2H，d，J=6.5 Hz，H-2′，6′），6.91（2H，d，J=7.1 Hz，H-3′，5′），6.37（1H，s，H-8），6.13（1H，s，H-6）；13C NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ：156.3（C-2），136.3（C-3），176.8（C-4），160.7（C-5），100.4（C-6），165.8（C-7），93.2（C-8），158.7（C-9），103.7（C-10），122.0（C-1′），128.5（C-2′，6′），115.4（C-H-3′，5′），146.3（C-4′）。与文献对照[7]，鉴定化合物7 为山柰酚。

化合物8 黄色粉末，ESI-MS m/z：447[M-H]-，分子式为C21H20O11。1H-NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：12.57（1H，s，OH-5），10.40（2H，br s，OH-7，4′），8.02（2H，s，H-2′，6′），6.90（2H，s，H-3′，5′），6.43（2H，s，H-8），6.21（2H，s，H-6），5.45（1H，d，J=7.3 Hz，H-1′′），3.57-2.90（Glc-H）；13C-NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ：156.2（C-2），133.2（C-3），177.5（C-4），161.2（C-5），98.7（C-6），164.1（C-7），93.6（C-8），156.4（C-9），104.0（C-10），120.9（C-1′），130.9（C-2′，6′），115.1（C-3′，5′），159.9（C-4′），100.9（C-1′′），74.2（C-2′′），77.5（C-3′′），69.9（C-4′′），76.4（C-5′′），60.9（C-6′′）。与文献对照[8]，鉴定化合8 为山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物9 黄色粉末，ESI-MS m/z：447 [M-H]-，分子式为C21H20O11。1H-NMR（300 MHz，DMSO-d6）δ：12.48（1H，s，OH-5），8.07（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′），6.94（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′），6.80（1H，d，J=2.2 Hz，H-8），6.42（1H，d，J=2.1 Hz，H-6），5.09（1H，d，J=7.4 Hz，H-1′′）；13C-NMR（75 MHz，DMSO-d6）δ：147.6（C-2），136.1（C-3），176.2（C-4），160.4（C-5），98.9（C-6），162.8（C-7），94.5（C-8），155.8（C-9），104.8（C-10），121.6（C-1′），129.7（C-2′，6′），115.5（C-3′，5′），159.5（C-4′），100.0（C-1′′），73.2（C-2′′），76.5（C-3′′），69.7（C-4′′），77.2（C-5′′），60.7（C-6′′）。与文献对照[9]，鉴定化合物9 为山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

3.2 生物活性测定结果

采用MTT 比色法评价已分离鉴定的9 个化合物对皮质酮所致PC12 细胞损伤的保护作用。结果显示，化合物2～5 对皮质酮所致PC12 细胞损伤具有中等保护作用，EC50值分别38.68、29.26、25.63、45.72 μmol·L-1见表2，阳性药氟西汀EC5015.24μmol·L-1。