黑曲霉GOD基因在枯草芽孢杆菌中的表达

于思颖 程 鹏 张静博 曹平华 李元晓 马彦博 李 旺

河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471023

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一类含有黄素腺嘌呤二核苷酸（flavine adenine dinucleotide，FAD）的二聚体蛋白酶，能够特异性催化β-D-葡萄糖被氧化成葡萄糖酸和过氧化氢[1]。GOD 基于其安全无毒等特性广泛地应用于饲料添加剂、食品、制药和化学等领域[2-7]。

枯草芽孢杆菌（B.subtilis）作为一种革兰氏阳性菌，已被美国食品药品监督管理局（FDA）评为生物安全（Generally regarded as safe，GRAS）菌株[8]，具有易于培养、繁殖速度快、遗传背景清晰等特点。与大肠杆菌相比，其具有优异的蛋白分泌能力，方便下游表达产物的分离；同时，B.subtilis具有良好的发酵工艺技术，这为目的产物进一步扩大生产提供了基础。B.subtilis表达系统已表达了多种产物并广泛应用于制药、食品和饲料等行业中[9-13]。

目前，大部分GOD 为野生菌或诱导菌生产，存在酶活力低且后续纯化困难等问题，基因工程表达的GOD宿主多为毕赤酵母，由于毕赤酵母的表达往往需要甲醇诱导，难以直接应用于饲料和养殖生产。因此，本研究克隆了来源于黑曲霉的GOD 基因，以野生型动物益生菌为宿主，以期获得高效表达GOD 的枯草芽孢杆菌，推动其在动物养殖中的应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1）土样：采自河南省洛阳市某葡萄园，采用多点混合法采集0～10 cm的土壤。

2）菌株、质粒和引物见表1。

表1 本试验所用菌株、质粒和引物

3）主要试剂：邻联茴香胺、辣根过氧化物酶、真菌DNA提取试剂盒购自上海生工生物有限公司；Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker、蛋白质Marker 购自Takara 公司；T4DNA 连接酶、NotI、NdeI、HindⅢ限制性内切酶购自Sigama 公司；……