华蟾素通过wee1蛋白调控卵巢癌细胞SKOV3的增殖与凋亡

郭 镜，高 月

（1.锦州医科大学附属第三医院康复科，辽宁锦州 121001；2.重庆市北碚区中医院检验科，重庆 400700）

人wee1基因位于11p15.1～11p15.3，编码含有647个氨基酸的蛋白质，是一种属于丝氨酸/苏氨酸家族的蛋白激酶。wee1蛋白激酶在人类多种恶性肿瘤中呈高表达，参与肿瘤的各种生物学行为[1-2]。本课题组前期研究发现，wee1激酶在卵巢癌组织中高表达，沉默wee1表达能够抑制卵巢癌细胞的增殖与侵袭转移。华蟾素(cinobufotalin,CINO)是传统中药材蟾皮的水煎煮提取物，具有清热、解毒、消肿、化瘀等功效，并对肿瘤具有较强的抑制作用[3-4]。文献报道，CINO在卵巢癌中能够抑制卵巢癌细胞的生长、促进细胞凋亡和抑制细胞侵袭转移[5-6]，但尚未见报道其抑制作用是否与wee1的表达有关。本研究对此进行实验观察，以明确wee1的表达变化与CINO治疗卵巢癌的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料人卵巢癌SKOV 3细胞购自中科院上海细胞库，RPMI-1640培养基购自美国Invitrogen公司，CCK 8试剂盒购自Promega公司；pcDNA-wee1过表达载体由上海吉玛基因公司构建。鼠抗人wee1、Bcl-2、Bax、Caspase-3单克隆抗体和兔抗鼠β-actin多克隆抗体购自Abways公司。Annexin V-FITC/PI试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司。

1.2 构建并鉴定转染wee1过表达SKOV3细胞SKOV 3细胞培养于含100 mL/L FBS的RPMI-1640培养液，37℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中。按1×105/孔细胞接种于6孔板，待细胞生长达50%汇合时，按Lipofectamine 2000说明书转染细胞。wee1过表达组转染pcDNA-wee1过表达载体，另设无转染组、转染pcDNA组。

Real-time PCR检测转染细胞wee1的表达：转染48 h，收集各组细胞提取总RNA并测定RNA浓度。1μg RNA为模板，按RT-PCR逆转录试剂盒合成cDNA；1μL cDNA为模板，进行Real-time PCR反应。Wee1基因正义链5'-CCACCACCCT-GCCAGT⁃TAA-3'，反 义 链5'-TAAACTTTTGT-GCAAC⁃CAGGGTAA-3'。反应条件：95℃10 s，95℃5 s，60℃15 s，72℃15 s，45个循环。基因相对表达用2-△△CT法确定。……