城中湖与长江城区段超微型真核浮游生物多样性比较研究

李运涛，李 欢，余 思，陈 倩 , 侯建军

(1.蚌埠学院，安徽 蚌埠 233030；2.食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室，湖北 黄石 435002)

0 引言

浮游生物在水生态系统中扮演着重要的角色，它们具有非常重要的生态作用[1，2]。在淡水研究中，通常将直径在0.2～5 μm之间的真核浮游生物定义为超微型真核浮游生物，它们数量庞大、分布广泛，在淡水生态系统中扮演着不可或缺的角色[3，4]。水体中的超微型真核浮游生物的多样性与该水体的营养状态有关，不同营养状态的水体中浮游生物会有不同的群落组成，故水体的营养状态可以用超微型浮游生物的群落组成来判断[5]。

磁湖位于湖北省黄石市市区，是黄石市区内最大的淡水湖，面积约为8平方千米；长江黄石段是黄石地区最大的活水流，流经黄石市区。磁湖与长江代表了静止和流动两类不同的水体，目前关于这两类水体浮游生物的对比研究还较少。

本研究采用高通量测序方法，对长江黄石段和磁湖的超微型真核浮游生物的多样性以及季节变化进行研究，探究不同流动状态的水体中浮游生物多样性的差异，研究结果可以为阐明区域水体的生物多样性特征及水环境变化规律提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

本研究选取湖北黄石市的城中湖——磁湖和长江黄石城区段作为目标水域，在2015年10月(秋季)以及12月(冬季)采样，在每个水域中各设置三个采样点，具体采样点的设置如图1所示。使用不锈钢分层采样器采集距离水表约0.5 m处的水样，每个采样点各取500 mL水样，然后将每个水域三个采样点的水样混合。混合水样先经筛绢过滤，接着用5 μm Isopore聚碳酸酯滤膜Isopore (Mil-lip re) 过滤，收集滤液，滤液接着用0.7 μm GF滤膜(Whatman)过滤，以收集超微型浮游生物样品，将过滤得到的样品膜于-80℃ 超低温冰箱保存。四个样本分别记为CJwin：长江冬季样本；CJaut：长江秋季样本；CHwin：磁湖冬季样本；CHaut：磁湖秋季样本。

图1 采样水域位置 (A: 磁湖; B: 长江)

1.2 理化指标的测定

本研究测定的理化指标有：总氮(TN)、总磷(TP)、pH、水温(WT)、化学需氧量(CODMn)。水温在采样现场由温度计直接测取，pH值使用pH计读取，其他理化指标测试方法均使用国家水环境监测的标准检测法。各水域的营养化程度采用综合营养状态指数(trophic level index, TLI)法进行评价。综合营养状态指数的计算选取总氮浓度、总磷浓度、化学需氧量3 个指标，具体计算方法及营养状态分级标准参考王鹤扬的方法[6]。

1.3 DNA提取，18S rRNA测序

本研究采用改良CTAB法提取样品中的总DNA，提取的总DNA 的质量用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。检测合格的样品DNA使用Illumina Hiseq PE300平台进行测序，测序由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。测序针对18S rRNA的V4区，使用通用引物：F-574(GCG GTA ATT CCA GCT CCA A)和R-952(TTG GCA AATGCTTTC GC)进行测序[7]。

1.4 数据处理

测序原始数据经拼接、质量过滤并去除嵌合体，得到高质量的 Tags 序列。在相似性 97% 的水平上对序列进行聚类(USEARCH ,version 10.0)。选取Silva数据库(Release128, http://www.arb-silva.de)进行物种比对，物种注释使用RDP Classifier进行，置信度阈值取0.8(version 2.2, http://sourceforge.net/projects/rdpclassifier/)。样本聚类分析使用非加权组平均法(Unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)，主坐标分析(Principal Coordinates Analysis，PCoA)和样本聚类均基于Bray- Curtis 距离。多样性指数计算、样本聚类、主坐标分析均基于OUT数据并使用R语言vegan包进行。使用Origin 2018绘制物种相对丰度柱形图、热图以及韦恩图。本次研究采用徐兆礼、陈亚瞿提出的优势度指数来判定优势种的组成，选取优势度指数>0.02的类群作为优势种[8]。优势度指数计算公式为：Y=(Ni/N)fi，式中N为样品中超微型真核浮游生物总序列数，Ni表示第i种类群的序列数，Fi为第i种类群在各样点出现的频率[8]。

2 结果与分析

2.1 采样点基本情况

由各样点的理化因子判断，各水域均是秋季营养化程度较高(表1)。根据综合营养状态指数判断，长江和磁湖站点在冬季处于中营养状态，两个站点在秋季则为轻度富营养状态。两个水域相比较，秋冬两季长江站点的营养化状态均低于磁湖站点。从季节上来看，两个水域的营养化状态均是秋季高于冬季。

表1 各样本理化因子数据

2.2 测序基本情况

四个样本测序共得到有效序列130 147条，序列平均长度为340bp左右。各个样本的稀释性曲线均趋向平坦，说明本次测序数据量是足够的。四个样本总共得到430个操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)，其中CHaut样本包含的OTU数目最多，为314个，CHwin样本包含的OTU数目最少，为213个(图2)。四个样本共有的OTU为129个，CHaut样本特有的OTU数目最多而CHwin样本特有的OTU数目最少，它们含有的OUT数目分别为35个和8个。对两个样本共有的OTU数目进行分析后发现，CHaut-CJaut样本共有的OTU最多，为228个，其次是CJaut-CJwin样本，共有的OTU为200个，CHwin-CJwin样本共有的OTU为 168个，CHaut-CHwin样本共有的OTU最少，为165个(图2)。

图2 韦恩图展示四个样本的OUT重叠

2.3 群落多样性分析

测序的4个样本中，磁湖秋季(CHaut)的Chao1指数最高，提示CHaut具有最高的群落丰富度(表2)。磁湖冬季(CHwin)的Chao1指数最低，显示CHwin 的群落丰富度是四个样本中最低的。两个水域中的Chao1指数的总体变化趋势均为秋季比冬季高，表明黄石水域中的磁湖及长江黄石段超微型真核浮游生物物种丰富度都是秋季比冬季高。在长江站点中Chao1指数在秋冬两个季节间的变化不大，相比之下，磁湖站点的Chao1指数随季节变化波动较大。Shannon指数和PieLou均匀度指数最高的样本是CJaut，但该样本的Chao1指数并不是最高的，这说明该样本的群落均匀度较高。长江站点的群落均匀度较磁湖站点高。群落丰富度方面则是秋季磁湖站点高，冬季长江站点高。总体来看，两个水域群落多样性均是秋季大于冬季，而长江站点的群落多样性高于磁湖站点。

表2 各样本多样性指数

两个水域中超微型真核浮游生物种类丰富，涵盖各大类群，包括藻类、真菌以及原生动物。在高阶分类单元上(绝大多数在门水平)，两个水域总共包含19个类群，此外还有大量的未分类序列(图3)。在磁湖站点中，两个季节相对丰度最高的均是绿藻，占比分别为50%(冬季)和32%(秋季)。根据优势度指数>0.02的标准，磁湖秋季居于优势的还有纤毛虫、Protalveolata、金藻、隐藻以及壶菌，而冬季居于优势的则还有隐藻、Protalveolata、纤毛虫以及隐真菌。长江站点中秋季Protalveolata处于绝对优势，秋季的优势类群还有纤毛虫、金藻、隐藻以及绿藻，此外还有一些真菌，如隐真菌和担子菌。与秋季不一样的是，长江站点中冬季金藻处于绝对优势，冬季优势类群还有绿藻、Protalveolata、甲藻、纤毛虫和隐藻。这些结果表明两个水域的物种组成差异较大，优势类群也不一样，而且优势类群总体上随季节变动而变动。检测到的绿藻中，主要为绿藻纲，Protalveolata主要为帕金虫科。在总共430个OTU中，相对丰度最高的10个OTU占总序列数的58.41%，这10个OTU分属于绿藻、隐藻等，其中OTU3(属于绿藻纲)在CHwin样本中占绝对优势，而OTU2(属于色金藻目)在CJwin样本中占绝对优势(图4)。

图3 不同样本超微型真核浮游生物门水平变化

图4 热图显示相对丰度前十的OTU

聚类分析结果显示(图5)，四个样本按季节聚成两个大的类群。PCoA分析得到了与聚类分析类似的结果(图6)，所测的4个样本沿着第一轴按季节分开，第一轴可以解释样品中所有差异的40.03%，表明季节对群落结构的影响最大。第二轴将4个样本按水域分开，第二轴可以解释样品中所有差异的33.64%.这些结果表明空间对群落结构的影响小于季节。

图5 4个样本群落结构聚类分析

图6 4个样本群落结构PCoA 分析

3 讨论

不同水域的营养和水文状态会影响水域中的浮游生物组成[9]。本研究结果显示，长江黄石段水域超微型真核浮游生物多样性总体上大于磁湖水域，而长江黄石段水域营养状态总体小于磁湖水域，这些结果提示水体营养化加剧可导致浮游生物多样性降低。造成长江黄石段水域营养状态总体小于磁湖水域的原因，可能一部分是因为长江水体流动性较强，自净能力较强，而磁湖为静止水体，自净能力稍弱。我们的结果还显示季节对群落结构的影响大于空间，这可能是因为两个水域相距较近，空间因素的影响较弱，季节变动会引起营养元素及水温的较大变化，而水温及营养元素是影响浮游生物生长的关键因素[10，11]。金藻多分布于温度和有机质含量较低、透明度较大的水体，在寒冷季节生长旺盛[12]。长江站点冬季营养化程度在四个样本中最低(TLI=38.61)，这或许可以部分解释为什么金藻在长江站点冬季处于绝对优势。

两个水域的优势类群主要是藻类，但也有原生动物和真菌。秋季长江站点中隐真菌为优势类群，目前对隐真菌的了解还不多。隐真菌主要在水环境中发现，已知某些隐真菌寄生于壶菌中[13]，而壶菌寄生于初级生产者中[14]，这提示隐真菌有可能通过壶菌对初级生产者进行调控，并在水体微食物网中发挥重要作用。然而有关隐真菌作用于水体微生物网的定量研究还极少[15]。