LINC00261和miR-31在结直肠癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性

孙 剑，高 杨，康荣基，黄 毅,陆 林

目前,结直肠癌发病率逐年上升[1]，且发病呈现年轻化趋势[2]。结直肠癌总生存率近10年没有明显升高趋势，尤其是晚期结直肠癌患者[3]。现结直肠癌发病机制的研究及治疗方式的探讨仍是热点内容[4]。长链非编码RNA(lncRNA)在多种恶性肿瘤中具有调控作用，或许可作为恶性肿瘤预测、早期诊断及预后分析的标志物，或者将来可作为恶性肿瘤治疗的靶基因。长链非编码RNA00261(LINC00261)是一种lncRNA，在多种恶性肿瘤中作为抑癌基因对肿瘤生物学行为进行调控。LINC00261在胰腺癌、肝癌、肺癌和乳腺癌中介导细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等，并与肿瘤的恶性临床病理特征具有相关性[5-6]，但以往其在结直肠癌中的研究并不深入。本研究首先采用生物信息学技术对LINC00261在结直肠癌中的研究结果进行了萃取，预测了其下游靶标miRNA，并在组织和细胞水平进行了进一步验证，以期为深入研究LINC00261在结直肠癌中的作用及机制提供前期研究基础。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年6月—2020年5月辽阳市中心医院收治的行手术治疗的结直肠癌30例，男17例，女13例；年龄41～82(68.9±17.2)岁。30例均手术切除结直肠癌组织和距离癌组织边缘5 cm的正常结直肠组织标本各0.5 cm3置于液氮罐中保存。30例临床和病理资料均通过查阅病历进行收集，包括性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、血管神经浸润、TNM分期及分化程度。

1.2方法

1.2.1生物信息学分析：应用Linked Omics (http://www.linkedomics.org)进行癌症基因组图谱数据采集分析，对LINC00261在结直肠癌组织和正常组织水平的数据进行采集，并筛选与其相关联的miRNA。采用靶基因预测分析软件对LINC00261和miR-31的靶向调控进行结合位点预测。

1.2.2细胞培养：SW480、HCT116、HT-29及FHC细胞(购自中国科学院上海典型细胞库)采用贴壁细胞培养法，在锦州医科大学科学试验中心进行培养及传代，采用90% MEM培养基(购自美国GIBCO公司)，10%胎牛血清。培养条件：37 ℃，5%二氧化碳。细胞培养隔天换液，观察细胞生长状态，每组细胞至少经3次传代后取对数生长期细胞进行实验。

1.2.3qRT-PCR:采用qRT-PCR检测组织及细胞中LINC00261和miR-31表达。所用试剂盒包括Trizol试剂盒(购自美国Sigma公司)和逆转录试剂盒(购自日本TaKaRa公司)。取组织标本(结直肠癌组织及正常结直肠组织)3 mm3，在冰上剪碎，并研磨，采用Trizol试剂盒进行裂解和总RNA提取。对于细胞标本(SW480、HCT116、HT-29及FHC细胞)，取对数生长期细胞按照Trizol试剂盒说明书进行裂解及总RNA提取，采用紫外吸收法检测RNA质量，包括RNA液浓度、纯度和完整性。RNA逆转录为cDNA，反应体系如下：5 μl DEPC水、0.2 μl逆转录Buffer、0.5 μl逆转录酶MMLV、0.2 μl下游引物、0.2 μl上游引物、0.1 μl dNTP、2 μl RNA模板。管家基因为GAPDH，对标准品进行梯度稀释，进行qRT-PCR，反应条件：93 ℃ 2 min，93 ℃ 1 min，55 ℃ 2 min，共40个循环。制备DNA模板用于绘制梯度稀释标准曲线,反应体系包括3 μl dNTP混合液、1 μl cDNA、1.5 μl MgCl2溶液、2.5 μl PCR缓冲液、1 μl Taq聚合酶、0.5 μl上游引物F、0.5 μl下游引物R。进行35个PCR循环。将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应，绘制溶解曲线。数据分析采用2-ΔΔCt。

1.3观察指标 应用生物信息学分析LINC00261在结直肠癌和正常结直肠组织中的表达及相关miRNA，采用qRT-PCR检测LINC00261和miR-31在结直肠癌和正常结直肠组织及细胞中表达，分析结直肠癌组织LINC00261和miR-31表达与结直肠癌患者临床病理特征的相关性，探讨结直肠癌组织LINC00261和miR-31表达的相关性。

2 结果

2.1生物信息学分析LINC00261在结直肠癌和正常结直肠组织中表达及相关miRNA 生物信息学分析结果显示，LINC00261在结直肠癌组织中表达低于正常结直肠组织，见图1a；结直肠癌组织中与LINC00261具有负相关性的miRNA见图1b；靶基因预测分析软件预测LINC00261与miR-31具有结合位点，可能具有靶向调控关系，见图1c。

图1 生物信息学分析LINC00261在结直肠癌和正常结直肠组织中的表达及相关miRNALINC00261为长链非编码RNA00261；1a.LINC00261在结直肠癌和正常结直肠组织中的表达；1b.结直肠癌组织中与LINC00261相关的miRNA；1c.LINC00261与miR-31相结合的预测靶点

2.2qRT-PCR检测LINC00261和miR-31在结直肠癌和正常结直肠组织及细胞中表达 qRT-PCR检测结果显示，LINC00261在结直肠癌组织中为1.116±0.586低于正常结直肠组织2.077±1.153；miR-31在结直肠癌组织中为2.239±1.145高于正常结直肠组织1.251±0.759(P<0.05)。LINC00261在结直肠癌细胞株中分别为0.247±0.060、0.443±0.170和0.393±0.248，低于正常结直肠上皮细胞1.249±0.286；miR-31在结直肠癌细胞株中分别为1.118±0.172、0.756±0.206和1.535±0.134，高于正常结直肠上皮细胞0.331±0.172(P<0.05)。见图2。

图2 qRT-PCR检测LINC00261和miR-31在结直肠癌和正常结直肠组织及细胞中的表达LINC00261为长链非编码RNA00261；2a.LINC00261在结直肠癌和正常结直肠组织中的表达；2b.miR-31在结直肠癌和正常结直肠组织中的表达；2c.LINC00261在结直肠癌细胞株和正常结直肠上皮细胞中的表达，与FHC比较，aP<0.05；2d.miR-31在结直肠癌细胞株和正常结直肠上皮细胞中的表达，与FHC比较，aP<0.05

2.3结直肠癌组织中LINC00261和miR-31表达与结直肠癌患者临床病理特征相关性 结直肠癌组织中LINC00261表达肿瘤直径>5 cm、血管神经浸润阳性、TNM分期Ⅲ或Ⅳ期和低分化程度结直肠癌患者低于肿瘤直径≤5 cm、血管神经浸润阴性、TNM分期Ⅰ或Ⅱ期和高中分化程度结直肠癌患者(P<0.05或P<0.01)。结直肠癌组织中miR-31表达肿瘤直径>5 cm和TNM分期Ⅲ或Ⅳ期结直肠癌患者高于肿瘤直径≤5 cm和TNM分期Ⅰ或Ⅱ期结直肠癌患者(P<0.05)。见表1。

表1 结直肠癌组织中LINC00261和miR-31表达与结直肠癌患者临床病理特征相关性

2.4结直肠癌组织LINC00261和miR-31表达相关性分析 Pearson相关性分析结果显示，结直肠癌组织LINC00261和miR-31表达呈负相关(r=-0.715，P<0.001，95%CI:-0.855，-0.478)，见图3。

图3 结直肠癌组织LINC00261和miR-31表达Pearson相关性分析LINC00261为长链非编码RNA00261

3 讨论

非编码RNA调控大部分人类基因的转录过程，在多种恶性肿瘤的发生和发展中具有明显调控作用[7]。lncRNA长度长于200个核苷酸，具有一定蛋白编码能力[8]。LINC00261在胰腺癌、前列腺癌及肺癌等组织中表达水平低于对应正常组织，并与药物治疗效果具有较强相关性[9]。以往文献有关结直肠癌组织LINC00261表达的研究极少。有研究报道，在不同肿瘤中，与LINC00261具有靶向调控关系的miRNA包括miR-324、miR-769、miR-124、miR-216b、miR-133a及miR-4735等[10]，但在结直肠癌中现尚缺乏该类研究数据。

本研究首先通过生物信息学分析对组织水平LINC00261的研究结果进行了萃取，结果显示LINC00261在结直肠癌组织中表达低于正常结直肠组织；进一步通过生物信息学分析收集了与LINC00261具有负相关性的miRNA，并通过靶基因预测分析软件预测发现LINC00261与miR-31具有结合位点，可能具有靶向调控关系。由于以往此类通过生物信息学分析的数据均来源于西方国家，样本量也较小，故本研究以结直肠癌手术切除的病理标本对其进行验证。本研究qRT-PCR检测结果显示，LINC00261在结直肠癌组织中表达低于正常结直肠组织，miR-31在结直肠癌组织中表达高于正常结直肠组织；LINC00261在结直肠癌细胞株中表达低于正常结直肠上皮细胞，miR-31在结直肠癌细胞株中表达高于正常结直肠上皮细胞。表明LINC00261在结直肠癌组织中的表达水平与生物信息学分析结果一致；miR-31在结直肠癌组织及细胞中表达上调，可能作为促癌基因发挥作用。miRNA作为非编码RNA在恶性肿瘤的发生和发展中具有重要生物学调控功能。有研究显示，lncRNA以海绵方式作用于miRNA[11-12]。本研究预测LINC00261与miR-31具有结合位点，但其调控关系需进一步实验证明。本研究结果显示，结直肠癌组织中LINC00261表达肿瘤直径>5 cm、血管神经浸润阳性、TNM分期Ⅲ或Ⅳ期和低分化程度结直肠癌患者低于肿瘤直径≤5 cm、血管神经浸润阴性、TNM分期Ⅰ或Ⅱ期和高中分化程度结直肠癌患者；miR-31表达肿瘤直径>5 cm和TNM分期Ⅲ或Ⅳ期结直肠癌患者高于肿瘤直径≤5 cm和TNM分期Ⅰ或Ⅱ期结直肠癌患者。表明LINC00261和miR-31与结直肠癌患者肿瘤直径和TNM分期等临床病理特征具有相关性。有研究显示，LINC00261在胃癌组织中表达下调，其低表达与胃癌患者临床病理特征具有相关性[13]。LINC00261在肺癌组织中也表现出同样的抑癌基因特征[12]。本研究结果与上述文献报道结果基本一致。本研究通过Pearson相关性分析对结直肠癌组织LINC00261和miR-31表达的相关性进行了探讨，结果显示结直肠癌组织LINC00261和miR-31表达呈负相关。因此，今后可行进一步研究对LINC00261与miR-31可能存在的靶向调控关系进行探讨。

总之，本研究通过生物信息学分析对LINC00261在结直肠癌组织中表达水平进行了观察，并进一步验证了LINC00261在结直肠癌组织及细胞中的表达水平，预测了其与miR-31的调控靶点，为进一步论证LINC00261通过miR-31调控结直肠癌细胞的作用及机制提供了前期实验基础，并为LINC00261作为结直肠癌诊断标志物、预后评价指标和未来治疗靶点的研究提供了新的靶标基因。