鸭甲型肝炎病毒1型与3型双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

林梦舟，吴 双，徐建生，谢 军，吴 植，姜 勇，朱善元*

(1.扬州大学兽医学院，扬州 225009；2.江苏农牧科技职业学院 江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，泰州 225300；3.江苏立华牧业股份有限公司，常州 213000)

近年来，随着中国水禽养殖产业的快速发展，鸭常见的传染性疾病不断增多[1]，导致鸭病的发病率和死亡率居高不下，给临床检测和防控带来了困扰，严重影响了水禽产业的健康发展，带来了巨大经济损失[2]。

鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis，DVH)是由鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis virus A，DHAV)引起的一种急性、高度接触性的病毒性传染病[3]，主要侵害4周龄以内的雏鸭，剖检时典型特征为肝肿大并带有出血点[4]，可通过消化道和呼吸道感染[5]。DHAV分为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3三种不同的基因型[6]。2010年以前，国内发病以DHAV-1型为主，2013年以后DHAV-3发病率明显高于DHAV-1[7]；同时也存在混合感染的现象[8]，二者的临床症状相似，仅凭剖检病变难以进行鉴别诊断[9-10]。

实时荧光定量PCR方法具有快速、高效、敏感性高、特异性强等特点[11]，本研究中建立的DHAV-1和DHAV-3双重TaqMan荧光定量PCR方法不仅能高效检测混合感染情况，还可以准确测定动物组织的病毒载量。临床疑似样品的检测结果表明，该方法适合临床推广、可适用于大规模样品检测。

1 材料与方法

1.1 病原和SPF雏鸭

DHAV-1、DHAV-3、新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭腺病毒3型(DAdV-3)、新城疫病毒(NDV)、鸭细小病毒(DPV)、H9N2亚型禽流感病毒(H9N2-AIV)、鸭圆环病毒(DuCV)，其中NDV基因来源为新城疫Ⅳ系活疫苗(LaSota)，其余均由江苏省生物制药高技术研究重点实验室鉴定、分离和保存。SPF种鸭蛋购自山东昊泰实验动物繁育有限公司，由本实验室自行孵化至10日龄或出雏，SPF雏鸭转移至隔离器饲养。……