不同益生菌在婴幼儿奶粉中的稳定性研究

罗 君， 曹文海， 邓 银， 李小英

（ 湖南展辉食品有限公司， 湖南 长沙 410000）

健康母亲每升乳汁含有109个细菌， 主要是由双歧杆菌属和乳酸杆菌属组成[1]， 同时母乳中还含有母乳低聚糖， 其作用主要是经肠道微生物发酵产生短链链脂肪酸、 促进有益微生物的生长、 抑制有害菌的生长繁殖、 保护肠道上皮组织的完整等。 婴儿身体内益生菌（ 双歧杆菌和乳杆菌） 的来源主要是通过母乳喂养的形式被给予， 而双歧杆菌和乳杆菌主要是通过免疫清除、 免疫调节等方式对婴儿肠道的免疫系统起作用， 同时也会提高胃肠道相应的免疫能力[2]。 研究结果表明， 经母乳喂养的宝宝其体内益生菌种类相较于奶粉喂养的更多样化， 主要是包括了肠杆菌和脆弱拟杆菌属， 添加益生菌在婴幼儿配方奶粉中有益于肠道微生物的生长繁殖， 如果配方奶粉中不进行相应的改进， 其奶粉中的有益菌明显少于改进配方奶粉[3]。

益生菌是一种有益于宿主健康的活性微生物，能够使肠道内的微生物菌群维持在相对平衡的状态[4-6]， 其主要作用是通过促进有益菌的生长、 抑制有害菌的增加， 从而提高人体免疫力。 由于生活水平和保健意识的提高， 益生菌因其特别的保健作用而受到人们的广泛关注。 目前， 国家卫生部要求只能添加以下9 种菌种， 包括嗜酸乳杆菌、 动物双歧杆菌、 短双歧杆菌等， 在婴幼儿配方奶粉中使用较多的是菌种a（动物双歧杆菌Bb-12） 、 菌种b（ 乳双歧Bi-07） 、 菌种c（ 嗜酸乳杆菌）[7-9]。 通过加速试验， 分析了添加益生菌的婴幼儿奶粉在不同的温度下活菌数的变化趋势， 为益生菌奶粉产品的监管提供技术参考和意见。

1 试验部分

1.1 原料

市售的婴幼儿配方奶粉： 一段（ 高油乳清粉、全脂乳粉、 脱脂乳粉、 乳糖、 碳酸钙、 复配矿物质、花生四烯酸、 二十二碳六烯酸等， 水分质量2.25%） ；二段（水分质量2.46%）； 三段（水分质量2.52%）。

益生菌： 菌种a（动物双歧杆菌Bb-12） 、 菌种b（乳双歧Bi-07）、 菌种c（嗜酸乳杆菌）。

1.2 仪器

分析天平、 人工气候箱、 高压灭菌器、 Bag Mixer 400 型均质机、 生物安全柜、 HWS-100G 型恒温恒湿箱、 移液枪、 生化培养箱、 三维V 型混料机等。

1.3 试验方法

1.3.1 益生菌配方粉的生产工艺

采用干混法向婴幼儿配方奶粉中添加益生菌，各菌种以现有的生产工艺生产并检测各个生产阶段益生菌的存活数量， 每份做2 个平行样， 益生菌配方粉的生产工艺为：

预混料（ 添加益生菌预混时间为15 min） →混料（混合搅拌时间为10 min） →装罐→贮藏。

1.3.2 加速温度的确定

以菌种a（ 动物双歧杆菌Bb-12） 作为预试验的菌种， 将其与基粉和营养素混合后灌装， 然后分别置于4 个温度下（25， 37， 44， 55 ℃） 进行加速试验， 试验过程中通过检测4 个温度下样品里的活菌数样品来确定加速试验过程中的最适温度。

1.3.3 不同益生菌稳定性的确定

分别向基粉（ 一段、 二段、 三段的奶粉） 中添加菌种a、 菌种b、 菌种c， 混合均匀置于37 ℃的条件下储存2 个月后测定其活菌数， 分析在最适加速温度的条件下， 探讨保存时间对益生菌在婴幼儿配方奶粉中的稳定性。 试验过程中样品中活菌数通过GB 78935—2010 中的方法来确定。

2 结果与分析

2.1 最适加速温度的确定

温度是益生菌婴幼儿配方乳粉中各个环节需要控制的因素之一， 包括了生产、 运输、 贮藏和食用过程。 温度主要是通过影响益生菌的活性来影响其生长繁殖， 温度过高或过低都会影响益生菌生长。有研究人员发现， 乳酸菌很难在37 ℃温度下正常生长， 且在高温下其活菌数降低至添加时的20%左右。有研究人员研究温度对益生菌的影响， 发现嗜酸乳杆菌能够在45 ℃左右的高温下生长繁殖。

益生菌加速试验是指在益生菌产品中其他营养素成分不衰减的情况下， 通过强化温度试验条件，使样品中的益生菌加速失效， 从而能在比较短的时间里得出益生菌在婴幼儿配方奶粉中的稳定性， 以便评估益生菌在正常条件下的可靠性或寿命指标。以菌种a（ 动物双歧杆菌Bb-12） 作为添加菌种， 在加速温度分别为25， 37， 44， 55 ℃的条件下研究加速温度对益生菌在奶粉中的影响， 测定不同温度体系下的活菌数。

55 ℃加速试验下菌种a 的活菌量见图1， 44 ℃加速试验下菌种a 的活菌量见图2， 37 ℃加速试验下菌种a 的活菌量见图3， 25 ℃加速试验下菌种a的活菌量见图4。

图2 44 ℃加速试验下菌种a 的活菌量

图3 37 ℃加速试验下菌种a 的活菌量

图4 25 ℃加速试验下菌种a 的活菌量

由图1 可知， 在55 ℃的加速温度下， 活菌数迅速降低， 在第2 天时活菌数由添加的1.5×108g-1已经下降至小于50 g-1， 由于菌种活性随温度的升高不断下降直至死亡， 所以55 ℃不宜作为加速试验的加速温度。

由图2 可知， 益生菌在44 ℃的加速温度下活菌数下降迅速， 其下降幅度没有55 ℃时大， 在加速试验的第2 天活菌量已经降低至3.0×107g-1， 但44 ℃的加速温度不利于比较菌种间的稳定性， 不能设定为加速试验的加速温度。

由图3 可知， 在37 ℃的加速条件下， 益生菌的活菌数由第1 天的1.5×108g-1下降至第40 天的4.0×107g-1。 在40 d 内益生菌的活菌数出现明显下降的趋势， 同时符合加速试验的相关要求， 有利于后续菌种间稳定性比较试验。

由图4 可知， 25 ℃下活菌数变化的趋势不明显，在长时间内活菌数没有明显的下降， 8 d 内， 活菌数由1.5×108g-1下降至1.4×108g-1。 此温度不符合加速试验的目的， 在短时间内不能分析不同菌种在婴幼儿配方奶粉中的稳定性。

综上可知， 在37℃下进行加速试验较为适宜，试验时间不会过长且能明显看出菌种的衰减， 有利于快速测定菌种的稳定性。

2.2 不同益生菌在婴幼儿配方奶粉中稳定性变化

2.2.1 菌种a（动物双歧杆菌Bb- 12） 的稳定性

在37 ℃的加速试验条件下， 测定添加菌种a 的婴幼儿配方奶粉2 个月内的活菌变化量。

37 ℃加速试验条件下菌种a 的活菌数见图5。

图5 37 ℃加速试验条件下菌种a 的活菌数

由图5 可知， 每段奶粉的活菌数在储存期间都呈现出下降趋势， 在初期下降较为快速， 随后缓慢下降， 但三段奶粉的活菌数在保存期间表现出不同的变化。 在10 d 内， 一段奶粉中的菌种a 的活菌量由添加时的5.5×108g-1降低为4.3×108g-1， 随后缓慢降至第60 天的3.93×108g-1； 二段奶粉的活菌量在10 d 内降到了4.2×108g-1， 较一段奶粉下降较为明显， 在随后的加速试验中， 呈现出缓慢下降的趋势， 在第60 天时， 活菌数已降低至3.52×108g-1； 三段奶粉在保存期活菌数下降更为明显， 10 d 内就下降至4.01×108g-1， 在第60 天时降低至3.02×108g-1，不同段的奶粉表现出明显的差异， 说明菌种a 对水分较为敏感， 总体来说菌种a 的稳定性较好， 可作为备选菌种添加在水分含量较少的乳粉中。

2.2.2 菌种b（动物双歧杆菌Bi- 07） 的稳定性

在37 ℃的加速试验条件下， 测定添加菌种b 的婴幼儿配方奶粉2 个月内的活菌变化量。

37 ℃加速试验条件下菌种b 的活菌数见图6。

图6 37 ℃加速试验条件下菌种b 的活菌数

由图6 可知， 每段奶粉在37 ℃条件下进行加速试验时， 10 d 内活菌量出现明显降低。 一段奶粉中菌种b 的添加量在10 d 内由3.5×108g-1降低至2.8×108g-1， 随后活菌数一直处于平缓下降的趋势，储存60 d 时活菌数也达到2.47×108g-1， 说明菌种b有较好的稳定性； 二段奶粉中菌种b 的活菌数在10 d内由3.5×108g-1降低至2.71×108g-1， 相比于一段奶粉， 下降幅度要大些， 但保存60 d 时， 两段的活菌数基本处于一致的状态； 三段奶粉的活菌数下降量明显大于一段、 二段奶粉， 在第60 天时， 活菌数降低至 2.31×108g-1， 其主要原因是奶粉中水分含量的不同， 水分越多越不利于保持菌种的稳定性， 而三段奶粉中的水分质量明显高于其他两段。 综上可知， 菌种b 在奶粉中保持着良好的稳定性。

2.2.3 菌种c 的稳定性

在37 ℃的加速试验条件下， 测定添加菌种c 的婴幼儿配方奶粉2 个月内的活菌变化量。

37 ℃加速试验条件下菌种c 的活菌数见图7。

图7 37 ℃加速试验条件下菌种c 的活菌数

由图7 可知， 三段不同的奶粉在保存的前10 d内活菌数都呈现出迅速下降的趋势， 一段、 二段活菌数量由添加的3.9×108g-1降低到1.82×108g-1和1.78×108g-1， 三段奶粉则降低至1.42×108g-1。 在后期保存过程中， 一段、 二段下降趋势基本一致， 在第60 天时， 下降到1.2×108g-1左右， 而三段奶粉中的活菌量降低到9.79×107g-1， 比一段、 二段奶粉中的益生菌下降快， 这种现象说明外界环境对菌种c 的影响较大， 失活快， 但后期还是较为稳定， 因此建议加大添加量投入到奶粉中， 但也要考虑到成本问题。

3 结论

研究了3 种益生菌对婴幼儿配方乳粉的稳定性，得出以下结论：

（1） 加速试验的最适温度为37 ℃， 因为该温度下的试验时间不会过长， 同时能明显看出活菌量的下降， 有利于比较菌株间的稳定性。

（2） 益生菌的稳定性试验表明， 在37 ℃的加速温度下， 菌种b 的稳定性最好， 在加速试验中存放2 个月活菌数也达到2.47×108g-1； 其次较为稳定的是菌种a， 而菌种c 如果能加大投产量也可以作为添加到奶粉中的备选菌株。