DBP和TPP联合暴露对斑马鱼胚胎发育的影响

张明君 户沙沙 姜伟伟 李艳 孙桂金

摘要 [目的]研究邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和磷酸三苯酯（TPP）单独及联合暴露对斑马鱼胚胎发育的影响。[方法]将受精后4 hpf（hour post-fertilization，hpf）斑马鱼胚胎分别暴露于DBP（0、0.5和1.0 mg/L）、TPP（0和0.5 mg/L）和TPP+DBP（0.5 mg/L+0.5 mg/L和0.5 mg/L+1.0 mg/L），统计72 hpf胚胎孵化率以及96 hpf仔鱼存活率、孵化率、畸形率和体长。[结果]DBP和TPP单独及联合暴露引起斑马鱼卵黄囊肿、心脏畸形、脊柱弯曲和尾巴畸形，导致斑马鱼孵化率和存活率下降、畸形率增加和体长缩短。[结论]DBP和TPP联合暴露对斑马鱼存活率、畸形率和体长影响存在交互作用，对孵化率的影响无交互作用。

关键词 DBP;TPP;联合暴露;斑马鱼胚胎;发育

中图分类号 S 917.4  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）20-0105-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.027

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effect of Combined Exposure to DBP and TPP on the Development of Zebrafish （Danio rerio） Embryos

ZHANG Ming-jun，HU Sha-sha，JIANG Wei-wei et al （School of Food Science and Engineering，Qilu University of Technology （Shandong Academy of Sciences），Jinan，Shandong 250000）

Abstract [Objective]To study the effect of individual and combined exposure to dinbutyl phthalate （DBP） and triphenyl phosphate （TPP） on the development of zebrafish embryos.[Method]Zebrafish embryos at 4 hpf（hour post-fertilization，hpf） were exposed to DBP （0，0.5 mg/L and 1.0 mg/L），TPP （0 and 0.5 mg/L） and TPP+DBP （0.5 mg/L+0.5 mg/L and 0.5 mg/L+1.0 mg/L）.The hatching rate of zebrafish embryos was recorded at 72 hpf，and the survival rate，hatching rate，malformation rate and body length of zebrafish larvae were recorded at 96 hpf.[Result]Exposure to individual and combined of DBP and TPP resulted in obvoius malformations in zebrafish，including yolk-sac edema，cardiac deformities，spinal curvature and tail malformation，decreased hatching and survival rates，increased malformation rate and reduced body length in zebrafish embryos.[Conclusion]It has an interaction effect on the survival rate，malformation rate and body length of zebrafish，and no interaction on the hatching rate of zebrafish.

Key words DBP;TPP;Combined exposure;Zebrafish embryos;Development

基金項目 国家级大学生创新创业训练计划项目（201910431048）。

作者简介 张明君（1997—），男，山东临沂人，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。*通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事食品毒理学研究。

收稿日期 2021-05-30

邻苯二甲酸酯类化合物（phthalates，PAEs）由于具有软化塑料和增强塑料弹性的特点，已广泛应用于食品包装、医疗器械、个人护理用品、玩具、清洁剂、润滑油等，是一类生产量大的人工合成化合物，是目前全球最常用的塑化剂。随着时间的推移，PAEs不断释放至环境，空气、土壤和水均受到 PAEs的污染[1-2]。人体血液、尿液和母乳等体液也检出了PAEs及其代谢物[3-4]。PAEs及其代谢物不仅具有生殖和发育毒性，而且存在致癌、致畸、致突变的潜在毒性，严重影响人类的健康[5-6]。阻燃剂是一类能够防止材料被引燃或者抑制火焰传播的助剂，由于溴代阻燃剂在环境中具有持久性、生物蓄积性等特点，在世界范围内被逐步禁用。有机磷阻燃剂（organophosphate flame retardants，OPFRs）价格较便宜，并具有良好的阻燃效果，且兼有增塑等功能，在纺织、化工、建材和电子等行业广泛应用，水、大气、土壤及生物体均受到OPFRs的污染[7]。人体尿液、血浆、头发、母乳等人体样本中也检测出了OPFRs[8-9]。OPFRs具有发育毒性、神经毒性、生殖毒性、心脏毒性、肝脏毒性等[7，10]，给生态环境和人类健康造成潜在威胁。 PAEs和OPFRs在环境中同时存在，人类面临同时暴露PAEs和OPFRs的风险。单独评价PAEs和OPFRs毒性作用不能反映它们在环境中的真实毒性效应，而联合毒性作用的研究更有助于客观地评价它们在环境中的真实毒性效应，目前关于两者联合毒性作用的研究数据仍较为有限。

邻苯二甲酸二丁酯（dinbutyl phthalate，DBP）是目前使用最普遍的PAEs之一，大气、水体、土壤和生物体中均发现了它的存在[11-12]。磷酸三苯酯（triphenyl phosphate，TPP）是典型的 OPFRs 之一，生产和需求量都相当高，在多种环境介质以及生物体内均有检出[13-15]。研究者已对DBP和TPP的单一毒性进行了深入研究[11-15]，而两者联合毒性作用的研究鲜见报道。斑马鱼是一种常见的热带淡水鱼，具有体型小、饲养管理容易、饲养成本低、体外受精和发育、繁殖周期短、产卵量大、胚胎透明、基因组与人类基因组有高度的同源性等特点，已成为继小白鼠后的第二大模式生物，广泛应用于发育学、毒理学和疾病研究中[16]。该研究以斑马鱼胚胎作为受试对象，探讨DBP和TPP单独及联合暴露对其发育的影响，可为PAEs和OPFRs联合毒性的研究奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 试剂  DBP（CAS 号：8474- 纯度99%）、TPP （CAS号：115-86-6，纯度≥99%）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。DBP和TPP溶解于DMSO配制成储液，4 ℃ 保存。苯硫脲（phenylthiourea，PTU，CAS号：103-85-5，纯度≥98%）购自美国 Sigma 公司;DMSO、NaCl、KCl、CaCl2、NaHCO3 均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 斑马鱼胚胎收集。试验用AB品系斑马鱼，购自上海费曦生物科技有限公司，参照《The Zebrafish Book》[17]对斑马鱼进行饲养和繁殖。试验前1 d晚上按雌雄1∶2比例将成年斑马鱼放入排卵缸内，并将雌雄斑马鱼用隔板分开。第2天早上拆除隔板进行光照，光照 1 h 后在显微镜下观察挑选发育正常的胚胎放入培养液（3.5 g/L NaCl、0.5 g/L KCl、0.1 g/L CaCl2、0.025 g/L NaHCO3）中培养至4 hpf（hour post fertilization，hpf），用于后续试验。

1.2.2 试验设计。试验分为6组，每个试验组 DMSO 含量0.001%（体积分数），各试验组的暴露剂量见表1。

1.2.3 DBP和TPP单独及联合暴露。

挑选健康4 hpf 的斑马鱼胚胎随机放入试验组，每组35个胚胎。选用玻璃培养皿，每个培养皿放入暴露液5 mL，每皿35个胚胎，恒温光控培养箱中（温度控制在28 ℃，光照/黑暗周期14 h/10 h）培养。24 hpf 后斑马鱼胚胎暴露液中加入0.003% PTU抑制黑色素生长，每天更换暴露液，并弃去死亡的胚胎，连续培养至96 hpf，试验重复 3 次。观察并记录各组96 hpf斑马鱼表型，72 和96 hpf 斑马鱼孵化数，96 hpf 斑马鱼存活数、畸形数和体长。

1.3 数据分析 采用SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），显著性检验通过LSD（Fishers least significant difference）法比较，所有结果均表示为平均值±标准差（±SD），P<0.05 为显著性差异。析因设计方差分析判断是否存在交互作用，P<0.05 表示存在交互作用。

2 结果与分析

2.1 DBP和TPP单独及联合暴露对斑马鱼仔鱼存活率的影响

从图1可以看出，与对照组相比，DBP和TPP单独及联合暴露均显著降低斑马鱼仔鱼存活率;与DBP 组相比，DBP和TPP联合暴露显著降低斑马鱼仔鱼的存活率;与TPP组相比，TPP+DBP-H 组斑马鱼仔鱼的存活率显著降低。双因素方差分析表明，DBP和 TPP 联合暴露对斑马鱼仔鱼存活率的影响存在交互作用。

2.2 DBP和TPP单独及联合暴露对斑马鱼孵化率的影响

从DBP和TPP单独及联合暴露对斑马鱼胚胎和仔鱼孵化率的影响（图2、3）可以看出，与对照组相比，DBP-H及TPP+DBP-H组72 hpf 斑马鱼胚胎的孵化率显著降低;与TPP组相比，TPP+DBP-H组胚胎的孵化率显著降低。与对照组相比，TPP+DBP-H组 96 hpf 斑马鱼仔鱼的孵化率显著降低;与TPP组相比，TPP+DBP-H组 96 hpf 斑马鱼仔鱼的孵化率显著降低。双因素方差分析表明，DBP和TPP联合暴露对斑马鱼仔鱼孵化率的影响无交互作用。

2.3 DBP和TPP单独及联合暴露对斑马鱼仔鱼致畸效应的影响 DBP和TPP 单独暴露均引起斑马鱼卵黄囊肿、心包水肿、脊柱弯曲和尾巴畸形，这与前人的研究结果相同[18-20]。DBP和TPP联合暴露引起的斑马鱼毒性表型与DBP和TPP 单独暴露引起的斑马鱼毒性表型相同。从图4可以看出，与对照组相比，DBP和TPP单独及联合暴露组（0.5 mg/L DBP除外）斑马鱼仔鱼畸形率显著增加;与DBP组相比，DBP和TPP联合暴露导致斑马鱼仔鱼畸形率显著增高;与TPP组相比，DBP和TPP联合暴露导致斑马鱼仔鱼畸形率显著增高。双因素方差分析表明，DBP 和 TPP联合暴露对斑马鱼仔鱼畸形率的影响存在交互作用。

2.4 DBP和 TPP单独及联合暴露对斑马鱼仔鱼体长的影响

从图5可以看出，与对照组相比，DBP-H及DBP和TPP联合暴露显著降低斑马鱼仔鱼体长;与DBP组相比，TPP和DBP联合暴露显著降低斑马鱼仔鱼体长;与TPP组相比，TPP+DBP-H组斑马鱼仔鱼体长显著降低。双因素方差分析表明，DBP和 TPP联合暴露对斑马鱼仔鱼体长的影响有交互作用。

3 讨论与结论

我国的大气、土壤和水源都受到了不同程度的污染，环境污染已经达到非常严重程度。为保护人类健康，各国科学家已经对环境污染物进行了一系列研究，以前的大多数研究主要集中在单一毒性效应，联合毒性效应研究较少。而在实际环境中，环境污染物均以混合物的形式存在，污染物联合毒性的评估在理论和应用方面都具有越来越重要的科学意义和实际价值。2013年，美国NIEHS就指出應以阐明环境混合物的健康效应作为其未来优先研究重点之一[21]。联合毒性作用的研究是当前环境毒理学研究的热点之一，开展环境污染物的联合毒性研究可为其健康风险评价和管理提供更加可靠的科学依据。

人类面临同时暴露邻苯二甲酸酯类化合物（PAEs）和有机磷阻燃剂（OPFRs）的风险，评价这两类化合物的联合毒性作用对人类健康的影响具有重要的意義。DBP和TPP是这两类化合物中典型的污染物，目前有关两者联合毒性作用的研究鲜见报道。该研究以斑马鱼胚胎作为受试对象，探讨DBP和TPP单独和联合暴露对发育的影响，结果表明DBP和TPP 单独暴露引起斑马鱼畸形，导致斑马鱼孵化率和存活率下降、畸形率增加和体长缩短，这与前人的研究结果一致[18-20];DBP和TPP联合暴露引起毒性表型与DBP和TPP 单独暴露引起的毒性表型相同，DBP和 TPP联合暴露也导致斑马鱼孵化率和存活率下降、畸形率增加和体长缩短。由此可见，DBP和TPP单独及联合暴露均影响斑马鱼胚胎发育。DBP和 TPP联合暴露对斑马鱼仔鱼存活率、畸形率和体长影响存在交互作用，对胚胎和仔鱼孵化率的影响无交互作用。该研究结果对PAEs和OPFRs联合暴露的健康风险评价具有重要意义，为这类物质风险管理提供有效的毒理学依据，对人类健康具有重要的现实意义。

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