胰腺癌细胞失巢凋亡相关抑制性分子研究进展

赵馨旭 黄林生 刘佳玲 余惠凡 李飞

1 湖北医药学院药学院，十堰 442000；2十堰市太和医院肝胆胰外科，十堰 442000

【提要】 失巢凋亡是细胞与细胞外基质或其他细胞脱离接触而诱发的程序性凋亡，有利于机体发育及组织自身平衡，对恶性肿瘤细胞转移及存活有重要作用。肿瘤细胞失巢凋亡抵抗在胰腺癌浸润转移过程中发挥重要作用，多种抑制胰腺癌细胞失巢调亡的分子通过干预肿瘤细胞失巢调亡而影响胰腺癌进展。

失巢凋亡(anoikis)是细胞与细胞外基质或其他细胞脱离接触而诱发的程序性凋亡[1]。正常生理状态下，细胞与细胞外基质失黏附时会引发失巢凋亡；病理条件下，具有失巢凋亡抗性的肿瘤细胞离开原位后可经淋巴或血液循环定位到远处新组织或淋巴结继续发展，即发生失巢凋亡抵抗，此过程是肿瘤扩散、转移与侵袭的前提[2]。肿瘤细胞失巢凋亡抵抗在胰腺癌浸润转移过程中发挥重要作用[3]，本文就抑制胰腺癌细胞失巢凋亡的相关分子及其在胰腺癌进展中的作用进行综述。

一、Bcl-2转录抑制因子1(Bcl-2 inhibitor of transcription 1，Bit1)

Bit1是唯一只受整合素负性调节的细胞死亡诱导因子，可通过下调Bcl-2表达发挥非caspase依赖型促凋亡功能[4]。研究表明，Bit1在胰腺癌组织中低表达且表达水平与胰腺癌神经浸润程度及血清癌胚抗原水平呈负相关[5]。已有的研究表明，当细胞与细胞外基质黏附时，Bitl可通过维持Integrin整合素信号通路活性状态，激活其下游PI3K/AKT信号通路，并磷酸化NF-kB，促使核内Bcl-2表达升高，发挥抑制细胞凋亡的作用。而细胞与细胞外基质失黏附时，Integrin整合素信号通路活性受到抑制，线粒体膜的通透性发生改变，Bit1蛋白从线粒体内膜向外膜迁移并发生磷酸化，从而促进细胞凋亡[5]。下调人胰腺癌PANC1细胞内Bit1表达水平可增强悬浮培养下PANC1细胞失巢凋亡能力，从而发挥促凋亡作用。与之相反，过表达的人胰腺癌MiaPaCa2细胞内Bit1表达水平可促进悬浮培养下MiaPaCa2细胞的凋亡，原因可能与胞质中的Bit1蛋白通过自身磷酸化与AES结合形成转录共调解复合物促进肿瘤细胞的凋亡有关。而贴壁培养的MiaPaCa-2细胞凋亡受到抑制，其可能通过激活Bcl-2的表达抑制细胞凋亡[6]。

二、局灶性黏着斑激酶(focal adhesion kinase， FAK)

FAK是以激酶依赖方式发挥作用的一种细胞质功能性蛋白[7]，与细胞迁移[8]、存活[9]、增殖[10]及黏附[11]密切相关。研究表明，FAK可增加细胞基质面积及局部黏附，抑制失巢凋亡。通过检测poly HEMA诱导的胰腺癌细胞失巢凋亡后各细胞系的凋亡能力表明，高表达FAK的PANC1细胞抗失巢凋亡能力更强，而低表达FAK的人胰腺癌细胞Capan2失巢凋亡敏感性明显高于对照组细胞系。沉默FAK基因可促进胰腺癌细胞失巢凋亡并逆转MiaAR细胞(MiaPaCa2衍生的稳定抗失巢凋亡亚系)的失巢凋亡抵抗。锚定依赖性培养下，抑制FAK可促进MiaPaCa2及MiaAR细胞的caspase活化。此外，在肿瘤异种移植(patient-derived tumor xenograft， PDX)的裸鼠胰腺内注射1×106个正常MiaPaCa2和MiaAR细胞及低表达FAK的MiaPaCa2和MiaAR细胞，结果表明FAK基因沉默可抑制肝转移[12]。

三、基质蛋白Del-1(developmental endothelial locus-1， Del-1)

Del-1是一种细胞外基质蛋白，因含3个重复的表皮生长因子(epidermal growth factor， EGF)样结构域及2个盘状结构I(discoidin-I)样结构域，又被称为EDIL3(epidermal growth factor-like repeats and discoidin I-like domains 3)。Del-1可通过诱导血管形成促进肿瘤生长，活化细胞因子或与肿瘤细胞表面特定受体结合，在肿瘤发生及发展中发挥重要作用[13-14]。研究表明，Del-1在胰腺癌中高表达且其表达水平与肿瘤神经浸润呈正相关。Del-1可抑制胰腺癌细胞PANC1及Aspc-1失巢凋亡，其机制可能是通过改变凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达进而促进肿瘤远处转移[15]。EDIL3在PDAC中高表达，可抑制胰腺癌细胞SW1990和BxPC3失巢凋亡，并促进非锚定依赖性肿瘤的生长。Jiang等[16]发现，给裸鼠背部皮下注射3×106个SW1990细胞，3周后显示EDIL3对PDAC肿瘤生长具有促进作用。此外，沉默EDIL3可显著促进caspase3及caspase7活性，其可通过改变Bcl-2家族蛋白表达发挥抗凋亡作用。

四、Eph受体酪氨酸激酶A2(phrintype-A receptor 2， EphA2)

促红细胞生成素产生肝细胞受体(erythropoietin producing hepatocellular receptor，Eph)及其配体ephrin[17]是受体酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinase， RPTKs)家族主要分支，EphA2作为促新生血管形成蛋白，可参与调节肿瘤血管生成[18-19]及肿瘤营养供应，在肿瘤发生、发展中起重要的作用[20-21]。研究表明，过表达EphA2可增强Capan2细胞的侵袭能力及失巢凋亡抗性，caspase3活性也随之增加。此外，降低MiaPaCa2细胞中EphA2的表达水平，可抑制FAK磷酸化，给予裸鼠皮下注射MiaPaCa2细胞可抑制PDX模型中肿瘤生长及转移[22]。

五、癌胚抗原相关黏附分子6(carcinoembryonic antigen related adhesion molecules 6， CEACAM6)

CEACAM6属于免疫球蛋白超家族，可通过糖基磷脂酰肌醇锚在细胞膜表面[23-24]。研究表明，CEACAM6基因沉默可降低PANC1、Capan2、MiaPaCa2及MiaAR细胞的失巢凋亡抗性。沉默CEACAM6可增强caspase介导的MiaPaCa2及MiaAR细胞的失巢凋亡敏感性，这一效应可被caspase抑制剂Z-Val-Ala-Asp-氟甲基酮(z-VAD-fmk)消除，其机制可能与下调CEACAM6后Akt活性下降及caspase8、caspase3活性升高相关[25]。人胰腺癌细胞BxPC3中CEACAM6与小凹蛋白1(caveolin-1， CAV1)交联可增强c-Src活性，进而磷酸化FAK，从而诱导细胞失巢凋亡抵抗，提高BxPC3细胞的侵袭能力[26]。

六、神经生长因子(nerve growth factor， NGF)

NGF是从其前体pro NGF中分离出的神经系统生物活性分子，对神经元再生、发育及分化起调节作用[27]。近期研究表明，下调PANC1和Aspc-1细胞中pro NGF表达水平可抑制PANC1和BxPC3细胞增殖及侵袭能力，促进细胞失巢凋亡，其机制可能是通过下调自噬相关蛋白Beclin-1(酵母ATG6同源物)及自噬相关蛋白5(autophagy-related protein 5， ATG5)的表达，上调泛素结合蛋白p62的表达水平，从而促进胰腺癌细胞失巢凋亡[28]。

七、对氧磷酶 (paraoxonase， PON)

PON2基因家族包括PON1、PON2及PON3，三者具有高度同源性[29]。其中PON2在细胞内发挥抗氧化作用，可促进恶性肿瘤生长及转移[30-31]。研究表明，PON2在胰腺癌中过表达，可通过刺激葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1，GLUT1)介导的葡萄糖转运阻止AMPK介导的失巢凋亡，从而促进PDAC转移。给予caspase抑制剂z-VAD-fmk可抑制下调PON2表达水平后诱导的PANC1和Aspc-1细胞的失巢凋亡。能荷表示细胞所处能量状态，对细胞代谢有重要调控作用。高能荷时ATP生成过程被抑制，而利用过程被激发；当能荷值低时，其效应相反。PON2与葡萄糖代谢相关酶GLUT1以及己糖激酶(hexokinase 2， HK2)基因敲除表型相似，下调PON2表达水平可显著降低ATP/ADP及ADP/AMP，继而导致肿瘤抑制因子叉头蛋白O3A(forkhead box O3， FoxO3A)及其下游促凋亡靶基因p53上调凋亡调制物(p53 up-regulated modulator of apoptosis， PUMA)的激活，从而诱导肿瘤细胞失巢凋亡，继而抑制PDAC的生长及转移[32]。

八、APOBEC3G(A3G)

APOBEC3是近年发现的具有脱氨基作用的一类胞苷脱氨酶，A3G为其家族成员之一，是具有抗病毒能力的病毒诱导蛋白，有广谱抗病毒功能，可参与病毒的防御应答，促使病毒DNA发生超突变[33-35]。A3G在肿瘤的进展过程中也发挥重要作用，可通过抑制miR-29介导的基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase， MMP2)促进结直肠癌肝转移[36]。A3G在胰腺癌中高表达，过表达的A3G通过抑制PTEN活性激活Akt通路，参与失巢凋亡抵抗，从而抑制BxPC3细胞失巢凋亡，并促进早期肿瘤形成。给予裸鼠侧腹皮下注射不同数量稳定表达A3G的BxPC3细胞(1×105、5×105、1×106、5×106)，4周后移植瘤生长情况表明，过表达A3G可抑制裸鼠致瘤实验后期肿瘤生长，其可能通过影响卷曲蛋白(frizzled， FZD)表达继而参与调控Wnt通路，从而抑制肿瘤生长[37]。

九、GRHL2

果蝇粒状头样(grainyhead like， GRHL)家族包括GRHL1(grainyhead-like 1，又称mammalian granyhead， MGR或LBP-32)、GRHL2(grainyhead-like 2,又称brother of mammalian grainyhead， BOM)和GRHL3(grainyhead-like 3，又称sister of mammalian grainyhead， SOM，或粒状头样上皮反式激活因子)，研究表明GRHL1和GRHL3的表达与皮肤鳞状细胞癌的发生呈正相关，GRHL2不仅调控表皮细胞分化，同时还可促进或抑制多种肿瘤细胞的增殖[38-39]。GRHL2在肝转移性PDAC细胞CFPAC-1中表达高于正常胰腺导管上皮细胞HPDE，其表达水平与E-cadherin及CD133呈正相关。降低CFPAC-1的GRHL2表达水平可促进细胞失巢凋亡，其可能通过诱导上皮细胞间质转化从而促进癌细胞迁移及侵袭能力。此外，GRHL2可调节PDAC的上皮可塑性及干细胞样特性，促进CFPAC-1细胞自我更新，对肿瘤发生和发展至关重要[40]。

十、miR-137

微小RNAs(microRNAs， miRNAs)是长度19～25个核苷酸的非编码小分子RNA，主要参与靶基因的转录后调控[41]。miRNA的异常表达与肿瘤的发生和进展密切相关，近期miRNA与胰腺癌失巢凋亡抵抗亦有相关报道。miR-137是一种肿瘤抑制因子，在胰腺癌中低表达[42]。上调miR-137表达水平后，胰腺癌细胞MiaPaCa2及PANC1侵袭迁移能力明显减弱[43]。此外，上调胰腺癌细胞PANC1及Aspc-1中miR-137表达水平可抑制细胞增殖能力并显著提高细胞凋亡能力[44]。研究表明，过表达的miR-137可抑制胰腺癌细胞PANC1及Aspc-1的失巢凋亡，其可能通过抑制桩蛋白(paxillin， PXN)活性而激活Akt通路，参与失巢凋亡抵抗[45]。

失巢凋亡对维护组织结构完整和内环境稳定具有重要意义。正常上皮细胞对失巢凋亡敏感度高，而肿瘤细胞可通过自分泌或旁分泌机制抑制失巢凋亡，通过促进肿瘤细胞浸润、刺激血管新生而生存。肿瘤细胞尤其是易发生远处转移的恶性肿瘤细胞都具有极强的抗失巢凋亡能力，该能力的获取被认为是恶性肿瘤细胞进行侵袭、转移的先决条件。

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