桑寄生总黄酮对链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠降糖作用机制研究*

蒙田秀 袁小玲 梁芳 杨立芳 龚志强,

(1.广西中医药大学赛恩斯新医药学院，广西 南宁 530222；2.广西民族大学化学化工学院,广西 南宁 530003)

目前，药用植物在控制糖尿病方面使用广泛，是安全有效的中药降糖药物的重要来源。黄酮类物质是很多药用植物的主要成分，具有很高的药理活性，能起到抗氧化、抗炎、神经保护、免疫调节、降血脂、降血糖等多方面药理作用[1]。现代药理学研究表明，黄酮类化合物对糖尿病疗效明显，可通过降低血糖、抑制α-葡萄糖苷酶、保护胰腺等多途径来对抗糖尿病[2-5]，使其发病率也明显降低。

桑寄生(HerbaTaxillus)为桑寄生科植物桑寄生(Taxilluschinensis(DC.)Danser.)的干燥带叶茎枝[6]，桑寄生主要化学成分之一为黄酮类化合物，已有相关报道证实桑寄生原药材具有抗炎镇痛，抗痛风、降血糖、抗肿瘤等相关的药理作用[7-9]。项目组前期开展了桑寄生总黄酮对链脲佐菌素致高血糖小鼠血糖血脂的影响[10]，表明寄生总黄酮对高血糖小鼠有很好的降糖作用，其作用机制尚未阐明。本实验以桑寄生总黄酮(Total FlavonoidHerbaTaxillus，TFHT)为对象，通过链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型，检测TFHT干预对小鼠体内α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的作用，并测定血糖含量和相关代谢酶等指标来探讨其降糖作用机制及对胰腺的保护作用，为下一步开发桑寄生药用研究提供理论依据。

1 材料与试剂

1.1仪器与设备 电子天平(BP211D电子分析天平，德国赛多利斯)；LG16-W型离心机(北京医用离心机厂生产)；TU-1901双光束紫外可见分光光度计(上海沪瑞明仪器有限公司)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；UV-1780全波长酶标仪(TECAN)。

1.2药材与试剂 美国Sigma公司链脲佐菌素(streptozocin，STZ)；盐酸二甲双胍缓释片(山东司邦得制药有限公司，国药准字H20081230)；芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100080-201408)、葡萄糖测定试剂盒(批号：20180805137)、丙二醛(MDA)测试盒(批号：20180621)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号：20180608)均购于南京建成生物工程研究所。桑寄生饮片从广西玉林中药材市场买进，由广西中医药大学赛恩斯新医药学院黄茂春副教授鉴定为桑寄生科植物桑寄生的干燥带叶茎枝。

1.3实验动物 KM小鼠，体重(20±2) g，动物合格证：SCXK(桂)2014-0002，购于广西医科大学实验动物中心，饲养于广西中医药大学动物实验中心SPF级实验动物室屏障环境，所有操作均严格按照实验动物伦理相关规定进行。温度：(23±3)℃，相对湿度(55±15)%，光照12 h明暗交替，自由饮水、进食，每周更换灭菌后的清洁垫料。

2 实验方法

2.1TFHT粉末的制备[11]用70%乙醇浸湿桑寄生饮片24 h后减压回流提取两次，收集两次的提取物进行浓缩回收乙醇，再低温浓缩得到浸膏。上D-101大孔树脂，先除去杂质(用20%乙醇洗脱)，再用乙醇进行梯度洗脱(30%、40%、50%、60%)，收集洗脱液，旋转蒸发回收乙醇，烘干粉碎即得到TFHT粉末。

2.2TFHT的含量测定[12]

2.2.1对照品溶液的制备 精密称定芦丁对照品10.86 mg(批号：100080-201408，供含量测定用，按92.8%计算，中国食品药品检定研究所)，置25 mL量瓶中，加50%乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加50%乙醇定容至刻度，摇匀，即得芦丁对照品溶液浓度为0.4344 mg·mL-1。

2.2.2供试品溶液的制备 精密称取桑寄生总黄酮(TFHT)干膏1.0 g，置50 mL量瓶中，加50%乙醇适量，超声处理30分钟，放冷，加50%乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3标准曲线制备 分别精密量取上述芦丁对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL置25 mL比色管中，各加水至6 mL，加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加入氢氧化钠溶液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟后，以相应的试剂作空白，照紫外-可见分光光度计法在500 nm处测定吸光度，以待测液浓度为X，以吸光度为Y做标准曲线，结果待测液浓度在17.376～104.256 μg·mL-1范围内和吸光度成良好线性关系，Y=0.0124X-0.0183，r=0.9992。

2.2.4TFHT含量测定 精密吸取上述供试品溶液，1 mL置25 mL比色管中(平行试验3份)，同法测定吸光度，计算总黄酮含量，结果TFHT粉末中桑寄生总黄酮含量为98.99 mg·g-1。

2.3TFHT体外降血糖作用研究

2.3.1测定TFHT对α-葡萄糖苷活性的抑制作用[13-14]按照文献[11]方法，稍作改良。分别取60 μL不同浓度(样品、阿卡波糖溶液，空白对照液)待测液于96孔酶标板中，再加入α-葡萄糖苷酶溶液40 μL混匀，放37 ℃15 min水浴，再加入40 μL对硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷溶液混匀，再次恒温水浴反应20 min后加入140 μL Na2CO3溶液来终止酶促反应，最后于405 nm波长测定吸光度(A)。总黄酮物质大多有颜色，所以每个样品都要测定背景吸收，并对最终的测定结果进行校正[12]。所有样品均测3次然后取平均值，按公式(1)计算抑制率。

抑制率=(1-As/A0)×100%

(1)

式中：AS为样品吸光度，A0为空白对照组吸光度。

2.3.2测定TFHT对α-淀粉酶活性的抑制作用 按照文献[15-16]方法，稍作改良。取20 μL各待测液(阿卡波糖、样品、空白对照液)于比色管中，均加入α-淀粉酶溶液100 μL恒温活化10 min，再加入200 μL底物25 ℃反应10 min，最后加入1.0 μL DNS(A液与B液)来终止反应，并在100 ℃沸水中煮沸10 min，向比色管中补充10 mL生理盐水，冷却后在分光光度计540 nm测吸光度。按公式(1)计算抑制率。

2.3.3TFHT体内降血糖效果研究

2.3.3.1糖尿病小鼠模型的建立 取KM小鼠80只，适应养3 d，小鼠不禁水禁食12 h后，一次性腹腔注射STZ(320 mg·kg-1)，72 h后，用血糖仪测血糖值，选取血糖浓度>11 mmol·L-1的小鼠为合格的糖尿病模型。

2.3.3.2动物分组与给药 将合格的糖尿病小鼠50只按血糖值随机分为模型组，二甲双胍组(60 mg·kg-1)，TFHT高、中、低(600、300、150 mg·kg-1)剂量组，每组10只；另取10只健康的小鼠作为正常对照组。治疗组灌胃给药，每天1次，连续4周，期间正常喂养。在给药的1、2、3、4周分别眼球取血，分离血清，测定相关指标。最后取血完脱臼处死，称取肝脏适量，供肝糖原含量测定等。

2.4测定指标 开始灌胃给药前1天(第0周)，各组小鼠禁食不禁水12h后，分别称重。给药期间，每周固定时间称1次体重，记录每周小鼠体重的变化。并分别于第0、7、14、21、28天，各只小鼠眼眶静脉丛取血，分离血清，测定血糖含量。同时给药第4周后，小鼠空腹5 h后一次性灌胃葡萄糖4 g·kg-1，30 min后尾静脉取血测定0、0.5、1、2 h的血糖含量，同时计算血糖下曲线面积。最后取完血处死小鼠，解剖称取适量肝脏，供肝糖原含量测定。按照试剂盒说明书，分别测定小鼠血清血清胰岛素水平、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性。

3 结果与分析

3.1TFHT对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用 由表1可见，随着TFHT质量浓度的升高，α-葡萄糖苷酶的活性抑制率随之上升，TFHT浓度增加至2.0 mg·mL-1时达到最高，说明TFHT具有显著降糖能力，且对α-葡萄糖苷酶的抑制活性是剂量依赖型的。由表1可知，虽然随着TFHT质量浓度的增加，对α-淀粉酶的抑制活性也随之上升，但是抑制率却远低于阿卡波糖的抑制率。从表1可得知，TFHT是一种较强的α-葡萄糖苷酶抑制剂和较弱的α-淀粉酶抑制剂，并且显示明显的剂量依赖性。

表1 TFHT对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制

3.2TFHT体内降血糖效果

3.2.1TFHT对糖尿病小鼠血糖值的影响 由表2可知，模型组的血糖含量明显高于正常组，经过4周的治疗后发现，模型组糖尿病小鼠的血糖含量是正常小鼠的4.3倍(P<0.001)，经过不同剂量TFHT的治疗发现，治疗过后的糖尿病小鼠的血糖含量显著降低，各剂量组糖尿病小鼠的血糖含量与模型组相比降低显著(P<0.05)，且高剂量组小鼠的血糖含量跟二甲双胍组小鼠的血糖含量在4周后比较相近，结果说明TFHT具有较强的降血糖效果，并体现为剂量依赖性。

表2 对糖尿病小鼠血糖含量的影响

3.2.2TFHT对糖尿病小鼠糖耐量的影响 由表3可知，TFHT 3个剂量组小鼠血糖含量均低于模型组，且TFHT中、高剂量组差异非常显著(P<0.001)。表明TFHT具有明显降低糖尿病小鼠血糖耐量的作用。

表3 对糖尿病小鼠糖耐量的影响

3.2.3TFHT对糖尿病小鼠血清胰岛素含量的影响 由图1可知，模型组含量明显减少，仅为正常小鼠血清胰岛素含量的39%，经过4周的二甲双胍和TFHT的治疗后，结果发现，与模型组比较，二甲双胍和TFHT剂量组小鼠血清胰岛素含量都有明显的变化，都明显高于模型组小鼠的血清胰岛素含量，特别是TFHT高剂量组小鼠血清胰岛素的含量增加最多。

图1 TFHT对糖尿病小鼠血清胰岛素含量的影响

3.2.4TFHT对糖尿病小鼠肝糖原含量的影响 在糖尿病小鼠中，肝糖原含量的减少原因主要是因为胰岛素含量的缺少和肝糖原的合成受抑制造成，由图2可知，经过4周的TFHT和二甲双胍的治疗后，胰岛素的含量显著增加，与模型组相比较，正常组小鼠肝糖原的含量是糖尿病小鼠肝糖原含量的2.8倍，TFHT 3个剂量组小鼠肝糖原含量分别是模型组的2.6、2.0、1.3倍，说明TFHT可以从促进肝糖原的合成。

图2 TFHT对糖尿病小鼠肝糖原含量的影响

3.2.5对糖尿病小鼠胸腺指数、SOD、MDA含量的影响 由表4可知。与模型组比较，给药4周后，二甲双胍组和TFHT高剂量组小鼠胸腺指数显著升高(P<0.01，P<0.05)，SOD活性亦显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)，表面TFHT对糖尿病小鼠有升高SOD活性，降低MDA含量，保护胸腺萎缩的作用。

表4 对糖尿病小鼠胸腺指数、SOD、MDA含量的影响

4 讨论

目前普遍认为，导致糖尿病的主要原因是胰岛素降低和胰岛β细胞的功能缺陷，而STZ的羟基结构活泼，可直接损伤胰腺β细胞，甚至诱导胰岛β细胞凋亡[17-18]，从而快速升高血糖，所以STZ易造成高血糖模型[19]，同时也是诱导其它胰岛素抵抗相关，导致的高血糖、血脂异常代谢性动物模型，例如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)等[20]。现代药理学研究发现，目前对桑寄生的降糖作用仅有体外降血糖研究，其是通过加速肝脏的葡萄糖代谢，同时增强肝细胞对胰岛素的敏感性，从而降低血糖水平[21]。罗泽萍[22]近年通过对桑寄生醇提物体内降糖研究发现其能明显降低T2DM模型小鼠的FBG、FINS水平及HOMA-IR值，升高ISI值，表明其具有明显的降血糖、提高胰岛素敏感性及改善胰岛素抵抗的作用，其机制可能与提高小鼠免疫功能、上调抗凋亡相关因子、下调促凋亡及促炎相关因子的表达，从而维护肝细胞功能状态、减轻肾细胞受损程度有关。本实验通过体外降糖实验发现TFHT有抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的作用。进而开展体内降糖实验，通过TFHT对STZ诱导糖尿病动物模型进行干预，结果显示各给药组能明显降低糖尿病小鼠的血糖值，增强葡萄糖耐受能力，表明糖尿病小鼠胰岛素抵抗力得到增强。这可能是桑寄生中的总黄酮物质促进胰岛素大量分泌而使血糖降低。同时各给药组小鼠MDA含量显著降低、SOD活性和胸腺指数明显增高，表明TFHT能在一定程度上抑制动物体内脂质过氧化，同时亦可保护糖尿病小鼠胸腺萎缩。

综合本次研究结果表明，TFHT对STZ诱导的糖尿病小鼠具有较好的降糖效果，并通过抑制小鼠体内脂质过氧化，保护糖尿病小鼠胸腺萎缩，但其降糖作用机制复杂，可能与TFHT有保护和修复胰腺β细胞，或可改善胰岛素抵抗及抗脂质过氧化等多方面的作用有关。