CRISPR/Cpf1单碱基编辑系统的构建及应用

李树磊，徐妙云，郑红艳，王磊

中国农业科学院生物技术研究所，北京100081

传统育种中利用的遗传变异主要来自于自然突变、物理或化学诱变，存在变异发生率低、周期长、位点不可控等缺点。成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas）系统作为第三代基因编辑技术，由单链引导RNA（single-guide RNA，sgRNA）与切割靶序列的Cas内切核酸酶组成，其主要依赖sgRNA引导核酸内切酶在目标基因组位置产生双链断裂（double-strand break，DSB）[1]，而DSB可通过非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）或同源重组（homology recombination，HR）2种方式进行修复，修复过程中会引起靶标位置核苷酸序列的缺失、插入或替换，从而实现基因编辑。

为满足不同的编辑目的，研究人员以CRISPR/Cas系统为基础，通过融合表达Cas9突变蛋白、胞嘧啶脱氨酶或人工进化的腺嘌呤脱氨酶，开发出能够对靶位点进行精准单碱基编辑的系统。该系统在不引起DNA双链断裂的情况下，实现胞嘧啶（cytosine，C）转化胸腺嘧啶（thymine，T）/鸟嘌呤（guanine，G）转化腺嘌呤（adenine，A）的替换，且通过不断改进可明显提高单碱基编辑效率，减少插入、删除（insertion and deletion，indel）和非预期突变[2−3]。该系统已成功在小麦（Triticum aesti⁃vum）[4]、水稻（Oryza sativa）[5]、棉花（Gossypium）[6]、玉米（Zea mays）[7]等物种上实现安全高效的单碱基替换编辑。但目前该系统仅利用nCas9蛋白突变体（Cas9 nicknase，nCas9）或dCas9蛋白突变体（deactivated Cas9，dCas9）作为效应蛋白，所识别的PAM序列为鸟嘌呤/胞嘧啶富集区。因此，利用现有的碱基编辑系统无法在腺嘌呤胸腺嘧啶富集区域进行高效的编辑操作。

Cpf1（CRISPR from prevotella and francisella 1）也被称为Cas12a，其与Cas9同属于Class2蛋白家族，虽然特征相似但仍存在差异：①Cas9需要CRISPR衍生的RNA（CRISPR derived RNA，crRNA）与反式激活RNA（trans-activating RNA，tracrRNA）靶向DNA，而Cpf1仅需crRNA作为向导，且Cpf1具有加工crRNA的能力[8]；……